ELISA直接竞争法原理+步骤+注意事项

ELISA直接竞争法原理+步骤+注意事项

做ELISA的你，有没有遇到过这种情况：目标分子太小，夹心法做不了，但又需要准确定量？这时候就该直接竞争法上场了。

直接竞争法专为小分子物质设计——激素、药物残留、小分子代谢物，因为分子量太小、表面表位太少，没法用两个抗体同时夹住，夹心ELISA不适用，所以需要换一种思路。

直接竞争法原理

直接竞争法的核心逻辑是：样本中的目标物和酶标抗原，一起竞争固相抗体上有限的结合位点。

微孔板预先包被了特异性捕获抗体。加入样本的同时，也加入酶标记的抗原。如果样本中目标抗原浓度高，就会占掉更多的抗体位点，酶标抗原能结合上去的就少，最终信号就弱。如果样本中目标抗原浓度低，酶标抗原就能更多地结合上去，信号就强。

一句话：信号越弱，浓度越高——信号强度与目标物浓度成反比。

三步操作流程

第一步：加样

向包被了抗体的微孔板中同时加入待测样本和酶标抗原。

第二步：孵育 + 洗板

封板后室温或37℃孵育，让抗原与抗体充分结合。孵育结束后彻底洗涤，去除未结合的物质。

第三步：显色 + 读数

加TMB底物避光显色，加终止液终止反应，立即用酶标仪在450nm或双波长下读取OD值。

?? 注意事项

1.信号方向是反向的：直接竞争法中，浓度越高，OD值越低。拿到数据先确认曲线方向，别把“高浓度”当成“没表达”。这是和夹心法最大的区别，也是最容易出错的地方。

2.限量抗体是竞争的前提：孔底包被的抗体量是固定的、有限的，样本中的目标抗原和酶标抗原需要竞争这些有限的位点。如果抗体过量，竞争就失效了，信号会失去区分度——这也是竞争法原理的根基。

3.样本和酶标抗原要同时加：两者同时加入孔中，确保从同一起跑线开始竞争。可以先在管中预混再加入，也可以分别加，关键是同步——如果先后加入，先加的那个就已经占据了优势。

4.必须设B0对照：不加样本、只加酶标抗原的孔叫B0，代表0%抑制的最大信号值。所有样本的抑制率都基于B0计算，没有B0就无法准确定量，所以每块板都必须设。

一句话总结

ELISA直接竞争法，就是让样本中的目标抗原和酶标抗原“抢”同一个抗体位点——抢到的越多，信号越弱；抢到的越少，信号越强。适合检测小分子物质，信号方向是反向的，千万别和夹心法搞混了。