犬（Canine）乳铁蛋白（LTF）ELISA检测试剂盒

产品货号：DM-Can45218

产品规格：48/96T

上海笃玛生物科技有限公司是专注于生命科学领域的高科技企业，秉承“以客户为中心、以产品为保障、以诚信为基础、以创新为宗旨”的发展理念，致力于为 科研工作者提供高质量的生物学试剂及解决方案。本试剂盒是公司核心产品线之一，采用自主研发的高特异性抗体对，基于经典的双抗体夹心法原理构建，可精准定量检测样本中的含量。

ELISA（酶联免疫吸附测定，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的核心原理是：抗原与抗体的特异性免疫反应 + 酶催化底物的化学显色反应，通过颜色深浅定量 / 定性判断样本中待测物浓度。

试剂盒的组成

ELISA 试剂盒标准操作流程（双抗体夹心法为例）

所有操作需严格遵循试剂盒说明书，以下为通用标准化流程，含核心操作要点：

实验前准备

提前 1 小时将试剂盒所有组分从冰箱取出，室温（20-25℃）避光平衡至室温，酶结合物、标准品需避免阳光直射，冻干标准品需按说明书精准复溶、静置。

提前开启酶标仪、洗板机，完成校准；配制工作液：浓缩洗涤液用纯水稀释至工作浓度，底物 A/B 液按 1:1 比例临用前新鲜混合。

确定实验布局，提前规划标准品梯度、空白对照、阴性对照、样本重复孔的位置，避免加样错误。

样本前处理

血清、血浆、细胞培养上清、组织匀浆等样本，需按说明书要求离心、稀释，去除沉淀、脂质、溶血杂质，降低基质效应；待测浓度超出线性范围的样本，需用样本稀释液梯度稀释后再检测。

加样与孵育

按布局，向对应孔中加入标准品梯度液、待测样本、对照品，每孔加样体积精准一致，加样时避免枪头触碰孔壁、产生气泡，加样完成后用封板膜严密封口。

按说明书要求，37℃恒温避光孵育，孵育时间严格遵守说明书，不可随意延长或缩短，孵育时避免封板膜翘起、液体蒸发。

洗板（核心关键步骤）

孵育结束后，快速甩去孔内液体，在吸水纸上 拍干残留液体，按说明书要求用洗涤液洗板 3-6 次，每次洗板需注满孔、静置 30 秒后甩干，确保洗板充分，去除未结合的游离物质。

洗板不 会导致本底飙升、结果偏差，洗板过度会导致复合物脱落、信号偏低。

加酶结合物与二次孵育

每孔加入精准体积的酶结合物工作液，封板膜密封后，按说明书 37℃恒温避光孵育，严格控制孵育时间。

二次洗板

重复洗板操作，洗板次数、参数严格按说明书执行，洗板完成后 拍干孔内残留液体，无可见液滴。

底物显色

每孔加入新鲜混合的底物工作液，轻轻混匀后，37℃恒温避光孵育显色，严格控制显色时间，显色过程需避光，避免强光导致底物自发显色、本底升高。

终止反应与读数

按顺序每孔加入终止液，轻轻混匀后，蓝色产物会立即变为黄色，终止后 10-30 分钟内，用酶标仪读取 450nm 处的 OD 值，必要时设置参比波长 630nm，降低孔间误差。

数据处理

以标准品浓度为横坐标，对应 OD 值为纵坐标，拟合四参数 Logistic 曲线（优先选择）或线性回归曲线，根据样本 OD 值，计算出样本中待测靶标的浓度，结合稀释倍数换算最终结果。

实验步骤

1. 试剂准备：实验前将所有试剂盒组分及样本恢复至室温（25℃左右），浓缩洗涤液用蒸馏水稀释至1×工作液，浓缩检测抗体、链霉亲和素-HRP按说明书比例用样本稀释液稀释至工作液，现配现用。

2. 加样：根据实验需求确定所需板条数量，空白孔加入50μL样本稀释液，标准品孔加入50μL不同浓度的标准品工作液，待测样本孔加入50μL处理后的样本（已稀释的样本直接加入，未稀释样本可根据情况用样本稀释液1:1稀释后加入）；随后向所有孔中加入50μL生物素标记检测抗体工作液，轻轻振荡混匀。

3. 孵育：盖上封板膜，置于37℃恒温箱中孵育60分钟。

4. 洗涤：小心揭开封板膜，甩去孔内液体，每孔加满1×洗涤液，静置30秒后甩去，用吸水纸拍干；重复此洗涤步骤3次，若使用洗板机，洗涤次数可增加1次。

5. 加酶：每孔加入80μL链霉亲和素-HRP工作液，轻轻振荡混匀，盖上封板膜，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤：重复步骤4的洗涤操作， 去除未结合的酶结合物。

7. 显色：每孔依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，轻轻振荡混匀，盖上封板膜，37℃避光孵育10分钟，此时阳性孔会逐渐呈现蓝色。

8. 终止：取出酶标板，迅速向每孔加入50μL终止液，轻轻振荡混匀，蓝色会立即转为黄色。

9. 检测：加入终止液后10分钟内，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值（若需校正，可在630nm波长处测定参考OD值，最终检测OD值=450nm OD值-630nm OD值）。

ELISA 试剂盒核心性能评价指标

这是判断试剂盒质量、是否满足实验要求的核心标准，也是试剂盒研发、稳定性验证的核心依据，呼应你之前关注的加速稳定性实验：

灵敏度：分为 检出限（LOD）和定量下限（LLOQ），LOD 是可检出靶标的 浓度，LLOQ 是可精准定量的 浓度，数值越低，试剂盒的检测能力越强。

特异性：通过交叉反应率评估，试剂盒与靶标结构类似物的交叉反应率越低，特异性越强，检测结果越准确，无假阳性干扰。

精密度：用变异系数（CV）评估，分为板内精密度（同一块板同一样本重复孔 CV≤10%）、板间精密度（同批次不同板同一样本 CV≤15%）、批间精密度（不同批次试剂盒同一样本 CV≤20%），CV 越低，重复性越好。

准确度：用加标回收率评估，向空白基质中加入已知浓度的标准品，检测回收率需在 80%-120% 之间，越接近 ，定量准确性越高。

线性范围：试剂盒可精准定量的靶标浓度区间，实验中样本浓度需落在该区间内，超出范围需稀释后检测。

稳定性：是试剂盒有效期标定的核心，分为 4 类，也是你之前关注的加速稳定性实验的核心应用场景：

实时稳定性：试剂盒在规定保存条件下，长期存放的性能稳定性，是有效期标定的金标准。

加速稳定性：37℃恒温放置 7-14 天，模拟长期保存的老化效果，快速预判试剂盒有效期。

开瓶稳定性：试剂盒开封后，按规定条件存放的性能稳定性，指导开封后的使用时限。

运输稳定性：模拟运输过程中的温度波动、震动等条件，验证试剂盒的运输耐受性。

结果计算

1. 首先计算每个标准品、空白孔及样本孔的平均OD值（复孔检测时），空白孔OD值作为阴性对照，用于扣除背景干扰。

2. 以标准品浓度为横坐标（X轴，对数坐标），对应的OD值为纵坐标（Y轴，线性坐标），使用专业绘图软件（如Excel、GraphPad Prism）绘制标准曲线，计算回归方程（R2值应≥0.99，确保标准曲线的可靠性）。

3. 将扣除背景后的样本OD值代入回归方程，计算出样本中[检测指标]的初步浓度，再根据样本的稀释倍数计算出样本的实际浓度。

试剂准备的注意事项

1.所有试剂按说明书指定温度保存（2–8℃ 或 -20℃）

2.避免阳光直射，酶结合物、底物需避光

3.不同批号试剂不可混用

4.加样前检查试剂是否浑浊、沉淀、变色，异常则弃用

5.所有试剂开盖后尽快使用，剩余按要求保存

售后服务

上海笃玛生物科技有限公司拥有专业的技术服务团队，为您提供全程技术支持。如您在产品使用过程中有任何疑问，或对产品质量有异议，请及时联系我们的技术顾问，我们将在24小时内响应，为您提供实验方案优化、问题排查等专业服务。

如何确保蛋白定量的准确性？

确保蛋白定量准确性的完整操作指南
蛋白定量是 WB 实验中最容易被低估但影响最深远的步骤，其误差会被后续的上样、电泳和检测过程逐级放大，最终导致实验结果完全不可比。即使是经验丰富的实验者，也可能因为忽略某个细节而产生 20% 以上的定量误差。以下是从方法选择到结果验证的全流程质控方案，经过大量科研实践验证，可将定量误差控制在 5% 以内。

一、选择与样本匹配的定量方法
这是确保定量准确的 步，方法选择错误会导致系统性的定量偏差，无法通过后续操作弥补。
BCA 法是绝大多数 WB 实验的 ，它对含有低浓度 SDS、Triton X-100 和还原剂的裂解液耐受性 ，这与 WB 常用的裂解液成分完全匹配。但要注意，当样本中 EDTA 浓度超过 10mM、β- 巯基乙醇浓度超过 5% 或 DTT 浓度超过 10mM 时，会显著干扰 BCA 反应，导致结果偏高。此时应先将样本用不含这些成分的裂解液稀释 2-4 倍后再定量，或者改用 Bradford 法。
Bradford 法完全不受还原剂和螯合剂的影响，但对 SDS 极其敏感，SDS 浓度超过 0.1% 就会导致染料沉淀，结果严重偏高。因此 Bradford 法只能用于不含 SDS 的温和裂解液样本，或者用于纯化蛋白的快速定量。如果必须用 Bradford 法测定含 SDS 的样本，可将样本稀释至 SDS 浓度低于 0.05%，或者在染料试剂中加入 0.1M 的 NaOH 来中和 SDS 的影响。
Lowry 法准确度 ，但操作最复杂，且对几乎所有 WB 常用的裂解液成分都敏感，现在已经很少用于常规样本定量，仅在需要极高准确度的纯化蛋白 定量时使用。紫外分光光度法只能用于无核酸、无杂质的纯化蛋白定量， 不能用于细胞或组织裂解液，因为核酸在 260nm 的吸收会严重干扰 280nm 的测定，导致结果偏高 2-3 倍。

二、绘制高质量的标准曲线
标准曲线是定量的基准，其质量直接决定定量结果的准确性，很多实验者的定量误差都来源于不合格的标准曲线。
标准品必须使用与样本完全相同的裂解液配制，这是消除基质效应的 方法。很多人习惯用水或 PBS 配制标准品，这会导致标准品和样本的反应环境不同，产生系统性偏差。正确的做法是：取适量用于裂解样本的空白裂解液，加入已知浓度的 BSA 标准品，配制成一系列浓度梯度的标准溶液。
标准曲线应至少包含 5 个浓度点，且浓度范围必须覆盖所有样本的预期浓度。不要使用超出线性范围的吸光度值进行计算，因为此时吸光度与蛋白浓度不再呈线性关系。对于 BCA 法， 线性范围是 20-200μg/mL；对于 Bradford 法， 线性范围是 5-100μg/mL。如果样本浓度过高，应先用相同的裂解液稀释至线性范围内再测定。
标准曲线的相关系数 R² 必须大于 0.99，否则说明实验操作存在问题，需要重新绘制。每次实验都必须重新绘制标准曲线， 不能使用之前实验的标准曲线，因为不同批次的试剂、不同的反应条件都会导致标准曲线发生变化。标准品应分装成小份，-20℃保存，避免反复冻融，反复冻融会导致 BSA 降解，影响标准曲线的准确性。

三、严格规范样本预处理
样本中的不溶性颗粒、杂质和降解产物都会干扰吸光度读数，导致定量结果偏高。
所有样本在测定前都必须 12000-15000rpm 离心 10 分钟，只取上清液进行测定。即使样本看起来完全澄清，也会含有肉眼看不到的微小细胞碎片和蛋白聚集体，这些颗粒会散射光线，导致吸光度读数偏高。离心后吸取上清时，枪头应悬于上清液中部，不要触碰管底和管壁的沉淀。
如果样本浓度过高，必须用与标准品相同的空白裂解液进行稀释， 不能用水或 PBS 稀释。用水稀释会改变溶液的离子强度、pH 值和基质成分，导致样本与标准品的反应条件不同，产生定量误差。稀释倍数 控制在 2-10 倍之间，稀释倍数过高会放大操作误差。
样本应避免反复冻融，每次冻融都会导致部分蛋白变性聚集，同时释放出细胞内的核酸和其他杂质，影响定量结果。如果样本已经冻融过，使用前必须重新离心去除新产生的沉淀。对于组织匀浆样本，由于杂质含量高， 在裂解后先进行一次高速离心，取上清后再进行定量。

四、标准化操作细节
定量实验对操作细节非常敏感，微小的操作差异都会导致显著的结果偏差。
加样时必须使用同一支经过校准的移液器，并且每个样本和标准品都使用新的枪头。加样时要缓慢准确，避免产生气泡，气泡会导致吸光度读数偏低。如果枪头内有气泡，应将液体打回管中，重新吸取。加样顺序应先加空白对照，再加标准品， 加样本，以减少交叉污染。
反应条件必须严格一致。对于 BCA 法，反应温度应控制在 37℃±1℃，反应时间 到 30 分钟；对于 Bradford 法，反应时间应控制在 5-15 分钟之间，且所有样本的反应时间必须完全相同。反应温度每升高 10℃，BCA 反应的颜色深度会增加约 2 倍，因此温度的微小波动都会导致显著的结果差异。
反应结束后应立即进行比色，BCA 法的颜色会随时间逐渐加深，Bradford 法的颜色会随时间逐渐变浅。比色时应使用相同的比色皿，比色皿的透光面要保持清洁，不要用手触摸。如果使用 96 孔板比色，应确保孔板干净无划痕，且每个孔的液体体积完全一致。

五、设置合理的对照与重复
空白对照和技术重复是检测和减少操作误差的重要手段。
必须设置空白对照，空白对照应使用与样本相同的空白裂解液，以消除裂解液本身的吸光度干扰。不要用水作为空白对照，因为水的吸光度与裂解液不同。如果使用 96 孔板比色，应在板的四周设置空白孔，以消除边缘效应的影响。
每个样本和标准品都应至少做 2 个技术重复，取平均值进行计算。如果两个重复的吸光度值差异超过 10%，说明操作存在误差，应重新测定。对于重要的实验， 做 3 个技术重复，以提高结果的可靠性。
此外，还可以设置一个内部质控样本，即在每次实验中加入一个已知浓度的质控样本，通过比较质控样本的测定值与理论值，来判断本次实验的准确性。如果质控样本的测定值与理论值差异超过 10%，说明本次实验存在问题，需要重新测定所有样本。

六、验证定量结果的可靠性
定量完成后，不要直接用于上样，应先对定量结果进行验证，确保其可靠性。
的验证方法是进行预实验上样，取等量的不同样本进行 WB 实验，检测内参蛋白的条带强度。如果内参条带的强度基本一致，说明定量结果准确；如果内参条带的强度差异很大，说明定量存在误差，需要重新定量。
此外，还可以通过比较不同稀释倍数的同一样本的测定值来验证定量结果的线性。例如，将一个样本分别稀释 2 倍、4 倍和 8 倍后进行定量，如果测定值与稀释倍数呈良好的线性关系，说明定量结果可靠；如果不成线性，说明存在基质效应或其他干扰因素。