产品货号：DM-Can45211

产品规格：48/96T

ELISA（酶联免疫吸附测定，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的核心原理是：抗原与抗体的特异性免疫反应 + 酶催化底物的化学显色反应，通过颜色深浅定量 / 定性判断样本中待测物浓度。

一、核心逻辑（所有 ELISA 都遵循）

1. 免疫识别：利用抗原（Ag）和抗体（Ab）之间高度特异性结合，只 “抓” 目标分子。

2. 酶标记放大：将酶（常用 HRP、AP）标记在抗体 / 抗原上，作为信号放大系统。

3. 底物显色：酶催化无色底物生成有色产物，颜色深浅与酶量成正比，也与待测物浓度成正比。

4. 比色定量：酶标仪测吸光度（OD 值），通过标准曲线计算待测物浓度。

试剂盒的组成

二、四大经典 ELISA 检测原理（最常用）

1. 双抗体夹心法（Sandwich ELISA）—— 最常用，测大分子抗原 / 蛋白

适用对象：大分子蛋白、细胞因子、激素、膜蛋白、分泌蛋白等（有多个抗原表位）。结构：捕获抗体 → 待测抗原 → 检测抗体（酶标 / 生物素化）。

步骤逻辑：

1. 固相载体（微孔板）预包被捕获抗体（Capture Ab）。

2. 加入样本，样本中的待测抗原（Ag）与捕获抗体特异性结合。

3. 加入酶标记检测抗体（Detection Ab-HRP），与抗原另一表位结合，形成：捕获 Ab - 抗原 Ag - 检测 Ab-HRP 夹心复合物。

4. 洗去未结合物质，加入底物 TMB，HRP 催化显色。

5. 加终止液，测 OD 值。颜色越深 → 抗原浓度越高。

特点：

特异性高、灵敏度高（pg/mL 级）。

适合大分子、多表位抗原。

不适合小分子（如激素、药物小分子，表位太少夹不住）。

 

2. 直接法 ELISA（Direct ELISA）—— ，测抗原

适用对象：已知抗原定性 / 半定量，或包被抗原的验证。结构：固相抗原 → 酶标一抗。

步骤逻辑：

1. 微孔板直接包被待测抗原（Ag）。

2. 加入酶标记一抗（Primary Ab-HRP），直接与抗原结合。

3. 洗板、加底物显色、测 OD。

4. 颜色越深 → 抗原量越多。

特点：

步骤最少、速度快。

但灵敏度低，一抗需酶标记，通用性差。

科研中多用于包被效率验证，少用于临床 / 定量。

 

3. 间接法 ELISA（Indirect ELISA）—— 主要测抗体（如抗体滴度、自身抗体）

适用对象：检测样本中的抗体（如 IgG、IgM、病毒抗体、自身抗体）。结构：固相抗原 → 一抗（样本抗体） → 酶标二抗。

步骤逻辑：

1. 微孔板包被已知纯化抗原（Ag）。

2. 加入样本，样本中的 待测抗体（Ab）与抗原结合。

3. 加入酶标记二抗（Secondary Ab-HRP，抗人 / 抗鼠 IgG 等），识别一抗 Fc 段。

4. 洗板、显色、测 OD。颜色越深 → 样本中抗体滴度越高。

特点：

灵敏度高，二抗可通用（同一酶标二抗可测多种一抗）。

主要用于抗体检测，不适合测抗原。

 

4. 竞争法 ELISA（Competitive ELISA）—— 测小分子抗原 / 半抗原

适用对象：小分子激素、药物、多肽、毒素、小分子代谢物（只有一个表位，无法夹心）。结构：固相抗体 / 抗原 + 酶标抗原 / 抗体与样本待测物 “竞争结合”。

有两种常见形式，原理一致、方向相反：

（1）抗体包被，酶标抗原竞争（最常用）

1. 微孔板包被捕获抗体。

2. 同时加入：样本待测小分子抗原 + 酶标记抗原（Ag-HRP）。

3. 两者竞争结合有限的抗体位点：

4. 样本中抗原多 → 占据更多抗体 → 酶标抗原结合少 → 显色浅。

5. 样本中抗原少 → 酶标抗原结合多 → 显色深。

6. 显色后，OD 值与待测抗原浓度成反比。

（2）抗原包被，酶标抗体竞争

1. 微孔板包被已知抗原。

2. 样本待测抗原 + 酶标抗体混合加入，竞争结合抗原。

3. 样本抗原多 → 酶标抗体结合少 → 显色浅。

特点：

必须用于小分子、单表位物质。

标准曲线是下降型（浓度越高，OD 越低），计算时注意方向。

特异性要求极高，否则易受结构类似物干扰。

三、信号系统原理（HRP + TMB 最常见）

绝大多数 ELISA 用这套：

1.酶：辣根过氧化物酶（HRP）。

2.底物：TMB（四甲基联苯胺），无色。

3.反应：HRP 催化 H₂O₂氧化 TMB → 生成蓝色可溶性产物。

4.终止：加硫酸（终止液），蓝色变为黄色，稳定。

5.读数：450 nm 测 OD（参考波长 630 nm）。

方法	主要检测对象	信息与浓度关系	适用分子大小	典型应用
双抗体夹心法	抗原（蛋白）	正相关（浓度高→色深）	大分子（多表位）	小分子、半抗原
直接法	抗原	正相关	大分子	抗原定性、包被验证
间接法	抗体	正相关	抗体	病毒抗体、自身抗体、免疫滴度
竞争法	抗原（小分子）	负相关（浓度高→色浅）	小分子、半抗原	类固醇激素、药物、多肽、毒素

ELISA 检测试剂盒结果计算
核心前提：所有计算与判定规则，优先严格遵循试剂盒说明书，不同方法学（夹心法 / 竞争法 / 间接法）的公式、阈值、质控要求存在差异，说明书为 准则。

通用数据预处理（所有检测必做，直接决定结果准确性）

计算前必须完成原始 OD 值的校正与质控，剔除干扰和无效数据：
双波长校正：用主波长（常规 450nm）OD 值，减去参比波长（630/650nm）OD 值，消除板底划痕、污渍、孔位差异带来的非特异性干扰。

空白孔背景校正：所有孔的校正后 OD 值，均需减去空白对照孔（仅加底物 / 终止液，无样本、抗原 / 抗体）的平均 OD 值，得到净 OD 值， 消除背景信号干扰。

复孔数据质控：同一样本 / 标准品的复孔，计算变异系数 CV=(标准差SD/均值)× ，要求CV≤10%，超出需剔除异常值；CV≤5% 为优秀，复孔偏差过大需重新检测。

对照有效性验证：阴性对照、阳性对照、标准品零孔的 OD 值，必须落在说明书规定的范围内，否则整板实验无效，不可进行后续计算。

一句话总结

双抗体夹心法：捕获抗体抓抗原，酶标抗体再夹心，色深 = 浓度高。

间接法：抗原抓样本抗体，酶标二抗放大，色深 = 抗体高。

竞争法：样本与酶标物抢结合位点，色浅 = 浓度高。