犬（Canine）胞外超氧化物歧化酶(SOD3)ELISA检测试剂盒

产品货号：DM-Can45201

产品规格：48/96T

ELISA 检测试剂盒的检测原理

ELISA 全称酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是目前生物检测领域应用最广泛的免疫分析技术，该试剂盒仅用于科研检测。

其核心总原理是：基于抗原与抗体的特异性免疫识别结合反应，耦合酶对底物的高效催化信号放大效应，将免疫结合的特异性信号转化为可通过酶标仪定量检测的显色 / 光信号；通过固相吸附与洗涤步骤实现结合态与游离态物质的 分离，最终实现对待测物（抗原或抗体）的高特异性、高灵敏度定性与定量检测。

一、ELISA 试剂盒的核心基础元件与作用

所有 ELISA 试剂盒均围绕四大核心元件构建，是实现检测的基础：

固相载体：主流为 96 孔 / 384 孔聚苯乙烯酶标板，可通过疏水作用稳定吸附蛋白类抗原 / 抗体，且不破坏其免疫活性，为免疫反应提供固定的固相界面。

免疫核心试剂：包被用捕获抗原 / 抗体、酶标记的检测抗原 / 抗体（酶标结合物）。基于抗原表位与抗体互补决定区（CDR）的特异性结合，是保证检测特异性的核心，可 程度避免交叉反应。

酶 - 底物信号系统：最常用辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。酶分子具备极高的催化效率，一个酶分子可在短时间内催化大量底物分子生成有色产物，实现检测信号的级联放大，让 ELISA 可检测 pg/mL 甚至 fg/mL 级别的微量待测物；产物的吸光度（OD 值）与待测物含量存在明确的剂量 - 效应关系，是定量检测的核心依据。

封闭与洗涤体系：封闭液（如 BSA、脱脂奶粉）用于覆盖酶标板上未吸附蛋白的空白位点，阻断非特异性结合，降低背景干扰；洗涤液用于 分离固相结合的免疫复合物与游离的未结合物质，去除样本杂质和多余试剂，保障检测结果的准确性。

二、主流 ELISA 试剂盒的分型检测原理

根据检测靶标、分子大小与应用场景的不同，商品化 ELISA 试剂盒主要分为以下 5 种经典类型，其中双抗体夹心法、竞争法、间接法为市场主流。

1. 双抗体夹心法（大分子抗原检测 ，最主流）

核心适用场景：检测具有至少 2 个独立抗原表位的大分子物质，如细胞因子（IL-6、TNF-α 等）、蛋白类肿liu标志物、病原微生物结构蛋白、抗体药物等。

核心原理步骤：

包被固化：将针对待测抗原的特异性捕获抗体固定于酶标板孔内，洗涤去除未结合的多余抗体，封闭空白位点。

抗原捕获：加入待测样本 / 标准品，样本中的待测抗原与固相捕获抗体特异性结合，形成 “捕获抗体 - 待测抗原” 复合物，洗涤去除未结合的样本杂质。

夹心结合：加入针对待测抗原另一独立表位的酶标记检测抗体，与复合物中的抗原结合，形成 “捕获抗体 - 待测抗原 - 酶标检测抗体” 的双抗体夹心结构，洗涤去除未结合的酶标抗体。

显色定量：加入酶对应底物，酶催化底物发生显色反应；终止反应后，通过酶标仪测定 OD 值。显色深浅（OD 值）与样本中待测抗原的含量呈正相关，通过标准品绘制的浓度 - OD 值标准曲线，即可计算出样本中待测抗原的精准浓度。

2. 竞争法（小分子抗原 / 半抗原检测核心方案）

核心适用场景：检测仅含单个抗原表位的小分子半抗原，如激素、农药、兽药、真菌毒素、药物残留、毒品代谢物等，也可用于部分抗体的定量检测。

核心原理（抗原包被型，商品化试剂盒最常用）：

包被固化：将待测抗原（或抗原 - 载体偶联物）固定于酶标板孔内，洗涤去除多余包被物，封闭空白位点。

竞争性结合：同时加入待测样本与固定剂量的酶标抗体，样本中游离的待测抗原，与固相板上包被的抗原，竞争性结合酶标抗体的有限结合位点。

竞争逻辑：样本中待测抗原含量越高，能与固相包被抗原结合的酶标抗体就越少；反之，待测抗原含量越低，结合到固相上的酶标抗体就越多。

显色定量：洗涤去除未结合的游离物质后，加入底物显色。OD 值与样本中待测抗原的含量呈负相关，通过标准曲线完成定量检测。

3. 间接法（抗体检测金标准方案）

核心适用场景：检测样本中的特异性抗体，如病原体感染抗体（乙gan、 抗体）、自身免疫抗体、疫苗免疫后的抗体滴度检测、过敏原特异性抗体检测等。

核心原理步骤：

包被固化：将与待测抗体对应的特异性抗原固定于酶标板孔内，洗涤去除多余抗原，封闭空白位点。

一抗结合：加入待测样本，样本中针对包被抗原的特异性抗体（一抗，即待测抗体）与固相抗原特异性结合，形成 “包被抗原 - 待测抗体” 复合物，洗涤去除未结合的杂蛋白与非特异性抗体。

二抗结合：加入酶标记的抗种属抗体（二抗，如酶标抗人 IgG 抗体），与复合物中的待测抗体结合，洗涤去除未结合的酶标二抗。

显色判定：加入底物显色，OD 值与样本中待测抗体的含量呈正相关，既可通过临界值判定阴阳性（定性），也可通过梯度稀释实现抗体滴度的定量检测。

4. 抗体捕获法（IgM 抗体早期感染检测专用）

核心适用场景：病原体急性感染的早期 IgM 抗体检测，如急性甲肝、新冠早期感染、优生优育 TORCH IgM 检测等，可有效排除样本中IgG 抗体的干扰，避免假阳性。

核心原理步骤：

包被：将抗人 IgM 抗体固定于酶标板孔内，洗涤封闭后，加入待测样本，捕获样本中所有的 IgM 抗体（包括待测特异性 IgM 和非特异性 IgM）。

抗原结合：洗涤后加入特异性抗原，仅与捕获到的待测特异性 IgM 结合。

酶标检测：加入酶标记的针对该抗原的特异性抗体，与抗原结合，再次洗涤后加入底物显色，OD 值与样本中待测特异性 IgM 抗体含量正相关。

5. 直接法（基础原型，极少单独用于商品化试剂盒）

核心原理：将抗原包被于固相板，封闭后直接加入酶标记的特异性抗体，抗原抗体结合后洗涤、显色，OD 值与结合的酶标抗体量正相关。

特点：操作简单、步骤少、实验周期短；但需为每种检测抗体制备专属酶标物，通用性差、成本高，且非特异性干扰强，仅适用于目标抗原含量较高的快速定性筛查、抗体特异性验证。

方法	主要检测对象	信息与浓度关系	适用分子大小	典型应用
双抗体夹心法	抗原（蛋白）	正相关（浓度高→色深）	大分子（多表位）	小分子、半抗原
直接法	抗原	正相关	大分子	抗原定性、包被验证
间接法	抗体	正相关	抗体	病毒抗体、自身抗体、免疫滴度
竞争法	抗原（小分子）	负相关（浓度高→色浅）	小分子、半抗原	类固醇激素、药物、多肽、毒素

三、ELISA 技术的核心核心优势原理

高特异性：基于抗原 - 抗体的免疫识别反应，仅针对靶标分子的特定表位结合，可 程度规避样本中其他物质的交叉干扰。

超高灵敏度：酶的级联催化放大效应，可将微量的免疫结合信号放大百万倍，实现常规方法无法检测的超微量物质定量。

宽线性定量范围：通过标准品梯度稀释构建标准曲线，可实现多个数量级范围内的精准定量，适配不同浓度样本的检测需求。

操作标准化、通量高：96 孔板体系可实现批量样本同步检测，操作流程标准化，适配自动化设备，适合临床与大规模筛查场景。

五、样本处理

1. 血清样本：采集jing脉血后，室温静置2-4小时，3000rpm离心10分钟，收集上层血清，避免溶血，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

2. 血浆样本：使用抗凝管（EDTA、肝素等）采集血液，采集后立即轻轻颠倒混匀，3000rpm离心10分钟，收集上层血浆，-20℃或-80℃保存。

3. 组织培养上清：细胞培养完成后，3000rpm离心5分钟，去除细胞碎片，收集上清液，-20℃保存。

4. 细胞/组织裂解液：取适量细胞或组织样本，加入预冷的裂解液，冰浴匀浆后，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清液，-80℃保存。

5. 所有样本在检测前需恢复至室温，震荡混匀，若有沉淀需再次离心去除，避免影响检测结果。根据样本实际情况，可使用样本稀释液进行适当稀释，确保检测浓度落在标准曲线范围内。

六、实验步骤

1. 试剂准备：实验前将所有试剂盒组分及样本恢复至室温（25℃左右），浓缩洗涤液用蒸馏水稀释至1×工作液，浓缩检测抗体、链霉亲和素-HRP按说明书比例用样本稀释液稀释至工作液，现配现用。

2. 加样：根据实验需求确定所需板条数量，空白孔加入50μL样本稀释液，标准品孔加入50μL不同浓度的标准品工作液，待测样本孔加入50μL处理后的样本（已稀释的样本直接加入，未稀释样本可根据情况用样本稀释液1:1稀释后加入）；随后向所有孔中加入50μL生物素标记检测抗体工作液，轻轻振荡混匀。

3. 孵育：盖上封板膜，置于37℃恒温箱中孵育60分钟。

4. 洗涤：小心揭开封板膜，甩去孔内液体，每孔加满1×洗涤液，静置30秒后甩去，用吸水纸拍干；重复此洗涤步骤3次，若使用洗板机，洗涤次数可增加1次。

5. 加酶：每孔加入80μL链霉亲和素-HRP工作液，轻轻振荡混匀，盖上封板膜，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤：重复步骤4的洗涤操作， 去除未结合的酶结合物。

7. 显色：每孔依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，轻轻振荡混匀，盖上封板膜，37℃避光孵育10分钟，此时阳性孔会逐渐呈现蓝色。

8. 终止：取出酶标板，迅速向每孔加入50μL终止液，轻轻振荡混匀，蓝色会立即转为黄色。

9. 检测：加入终止液后10分钟内，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值（若需校正，可在630nm波长处测定参考OD值，最终检测OD值=450nm OD值-630nm OD值）。

七、结果计算

1. 首先计算每个标准品、空白孔及样本孔的平均OD值（复孔检测时），空白孔OD值作为阴性对照，用于扣除背景干扰。

2. 以标准品浓度为横坐标（X轴，对数坐标），对应的OD值为纵坐标（Y轴，线性坐标），使用专业绘图软件（如Excel、GraphPad Prism）绘制标准曲线，计算回归方程（R²值应≥0.99，确保标准曲线的可靠性）。

3. 将扣除背景后的样本OD值代入回归方程，计算出样本中[检测指标]的初步浓度，再根据样本的稀释倍数计算出样本的实际浓度。

（仅供参考）

八、试剂盒性能

1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

2. 灵敏度： 检测浓度如资料所示。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

6. 有效期：6个月

九、储存与运输

1. 试剂盒未开封时，所有组分需密封置于2~8℃冷藏保存，避免冷冻，其中标准品冻干品可置于-20℃长期保存。

2. 试剂盒开封后，预包被酶标板需密封防潮保存，剩余试剂需按原储存条件保存，避免反复冻融，开封后建议在1个月内用完。

3. 运输过程采用冷链运输（2~8℃），避免高温、剧烈震荡，确保产品性能稳定。

十、注意事项

实验前请仔细阅读本说明书，严格按照实验步骤操作，确保实验条件（温度、孵育时间）符合要求。

所有试剂使用前需充分混匀，但避免剧烈震荡产生大量泡沫，以免影响加样精度。

洗涤步骤至关重要，需确保洗涤充分，避免未结合的杂蛋白或酶结合物残留，导致背景值偏高。

显色反应需避光进行，终止液加入后应立即检测OD值，避免放置时间过长导致颜色消退，影响检测结果。

实验所用样本、试剂及废弃物均需按生物安全规范处理，避免交叉污染。

本试剂盒仅用于科研用途，不用于临床诊断。

怎么收集培养瓶的细胞去做样本？

一、通用准备工作（所有细胞类型通用）
试剂耗材：预温至 37℃的 PBS（pH7.2-7.4）、对应细胞的完全培养基、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化液（贴壁细胞用）、15mL/50mL 无菌离心管、移液枪及无菌枪头、细胞刮（难消化细胞备用）、离心机（预冷至 4℃，按需）、冰盒、标记笔
安全与环境：全程在生物安全柜内无菌操作，佩戴手套、口罩和护目镜；提前 30min 开启超净台紫外消毒，用 75% 酒精擦拭台面和双手
样本标记：提前在离心管上清晰标记细胞名称、代次、收集日期、实验目的和样本编号
二、贴壁细胞收集（最常用）
标准胰酶消化法（适用于绝大多数贴壁细胞）
取出培养瓶，显微镜下观察细胞状态，确认汇合度达到 70%-90% 且无污染
倾斜培养瓶，用移液枪吸弃旧培养基，避免吸到细胞层
加入 3-5mL（T25 瓶）/8-10mL（T75 瓶）预温 PBS，轻轻晃动培养瓶洗涤细胞 1-2 次， 吸弃 PBS（去除残留血清，避免抑制胰酶活性）
加入 1mL（T25 瓶）/2mL（T75 瓶）预温胰酶 - EDTA 消化液，轻轻晃动使消化液均匀覆盖细胞层
置于 37℃培养箱中消化 1-3min，期间每隔 30s 取出显微镜观察：当细胞变圆、间隙增大、轻轻晃动培养瓶有细胞脱落时，立即终止消化
快速加入 3-5 倍体积的预温完全培养基（血清中的胰蛋白酶抑制剂可终止消化），用移液枪轻轻吹打瓶壁细胞面 3-5 次，将细胞吹打成单细胞悬液（吹打时避免产生气泡）
将细胞悬液转移至标记好的离心管中，用少量 PBS 或培养基冲洗培养瓶 1 次，合并冲洗液至离心管，减少细胞损失
离心：1000rpm（约 200-300g），室温离心 5min（离心力和时间根据细胞类型调整，敏感细胞可降低至 800rpm）
弃上清，根据实验目的进行后续处理：
用于蛋白 / RNA 提取：加入适量裂解液，冰上裂解后分装冻存
用于流式细胞术：加入预冷 PBS 重悬细胞，调整细胞浓度后进行染色
用于 ELISA / 细胞因子检测：直接取上清检测，细胞沉淀可用于其他实验
用于冻存：加入冻存液，分装至冻存管后梯度降温
难消化细胞补充方法
延长消化时间至 5-10min，期间轻轻拍打培养瓶侧壁
若仍有大量细胞未脱落，使用无菌细胞刮轻轻刮取细胞层，再加入培养基吹打
注意：细胞刮可能会损伤细胞膜，不适用于需要保持细胞活性的实验（如流式、传代）
三、悬浮细胞收集
取出培养瓶，显微镜下观察细胞状态和密度
将培养瓶中的细胞悬液直接转移至标记好的离心管中
用少量 PBS 或培养基冲洗培养瓶 1 次，合并冲洗液至离心管
离心：1000rpm（约 200-300g），室温离心 5min
弃上清，根据实验目的进行后续处理（同贴壁细胞）
注意
若细胞成团严重，可轻轻吹打细胞悬液使其分散后再离心
若需要收集培养上清用于检测，应先离心去除细胞碎片，再取上清分装冻存
四、不同实验目的的样本特殊处理
RNA 提取：全程使用无酶耗材和试剂；离心后立即弃上清，加入 Trizol 等裂解液；避免反复冻融
蛋白提取：离心后弃上清，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液；冰上裂解 30min
流式细胞术：保持细胞活性，避免剧烈吹打和离心；重悬时使用预冷 PBS；染色后尽快上机
细胞凋亡检测：收集所有细胞（包括漂浮的凋亡细胞）；避免胰酶消化过度
冻存样本：细胞沉淀重悬于含 10% DMSO 的冻存液中；梯度降温至 - 80℃，24h 后转移至液氮
五、关键注意事项与常见问题解决
消化时间控制：这是最关键的步骤。消化不足会导致细胞难以吹下，消化过度会损伤细胞膜，导致细胞破裂和内容物释放，影响后续实验结果。不同细胞系消化时间差异较大，建议预实验确定 时间
细胞损失问题：每次转移细胞悬液后，务必用少量 PBS 或培养基冲洗培养瓶 1 次，合并冲洗液；离心后弃上清时动作要轻，避免吸走细胞沉淀
污染防控：所有操作必须在生物安全柜内进行；试剂耗材需严格灭菌；不同细胞系之间操作时，需更换手套和枪头，避免交叉污染
样本稳定性：收集后的样本应尽快处理；若不能立即处理，可将细胞悬液置于 4℃冰箱保存，但保存时间不宜超过 2h；长期保存需分装后置于 - 80℃或液氮中，避免反复冻融

售后服务

上海笃玛生物科技有限公司拥有专业的技术服务团队，为您提供全程技术支持。如您在产品使用过程中有任何疑问，或对产品质量有异议，请及时联系我们的技术顾问，我们将在24小时内响应，为您提供实验方案优化、问题排查等专业服务。