犬（Canine）巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-1β)ELISA检测试剂盒

产品货号：DM-Can45163

产品规格：48/96T

ELISA 试剂盒，全称酶联免疫吸附试验试剂盒（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit），是基于抗原 - 抗体的特异性免疫结合特性，搭配酶促信号放大体系，实现对生物样本中目标物质精准定性、 定量的商品化成套实验试剂。它是生命科学、生物医药领域最主流的蛋白类物质定量工具，也是你此前检测细胞培养上清中目标因子、验证样本冻存合规性的核心实验载体。

ELISA 试剂盒为预制好的成套反应体系，无需自行优化配液，开箱即可使用，核心组分及对应作用如下：

预包被 96 孔酶标板：整个反应的固相载体，孔内提前固定了针对目标物的特异性捕获抗体，也就是你合并样本后分装上样的 ELISA 板，核心作用是特异性抓取样本中的目标物质。

标准品：已知精准浓度的目标物纯品，用于梯度稀释后构建标准曲线，是换算待测样本中目标物 浓度的 参照，你此前关注的「标曲 R²≥0.99」，就是针对该组分构建的曲线合格标准。

酶标检测抗体：针对目标物另一结合表位的特异性抗体，提前偶联了辣根过氧化物酶（HRP，最常用）或碱性磷酸酶（AP），可与捕获抗体、目标物形成稳定的 “夹心复合物”，通过偶联酶的催化作用实现信号放大，让微量目标物也能被检测到。

底物液：最常用的是 TMB 底物，可与 HRP 发生酶促反应产生蓝色显色产物，显色的深浅与样本中目标物的浓度呈严格正相关，是定量检测的信号来源。

终止液：多为稀硫酸溶液，可瞬间终止酶促显色反应，让蓝色产物转为稳定的黄色，终止后需在 10 分钟内用酶标仪读取特定波长下的吸光度值（OD 值），完成信号检测。

浓缩洗涤液：多为含吐温的 PBST 缓冲液，用于孵育后洗去孔内未结合的游离物质，降低非特异性结合带来的背景干扰，是保证检测结果准确性的核心组分，也是你此前关注的「洗板操作一致性」的核心物料。

样本 / 标准品稀释液：用于梯度稀释标准品和待测样本，可消除细胞培养基、血清等带来的基质效应，保证所有样本的反应体系完全一致，避 测结果失真。

封板膜：孵育时用于密封酶标板，避免孔内液体蒸发、外源污染，保证板内所有孔的孵育环境完全均一。

你检测细胞培养上清中蛋白类目标物，使用的几乎都是双抗体夹心 ELISA 试剂盒，这也是目前最主流的试剂盒类型，核心工作原理如下：

捕获阶段：将标准品、待测样本加入预包被了捕获抗体的酶标板孔中孵育，样本中的目标物会被捕获抗体特异性抓取，固定在孔底；

洗涤去除杂质：洗去未结合的游离蛋白、培养基杂质等非特异性物质，仅保留结合在孔底的目标物；

检测与信号放大：加入酶标检测抗体，与目标物的另一表位结合，形成 “捕获抗体 - 目标物 - 酶标检测抗体” 的夹心复合物，再次洗涤去除未结合的多余抗体；

显色与读数：加入底物液，复合物上偶联的酶会催化底物显色，加入终止液终止反应后，用酶标仪读取 OD 值；最终通过标准品的浓度和对应 OD 值拟合标准曲线，即可换算出待测样本中目标物的精准浓度。

根据检测目标物和反应模式，ELISA 试剂盒主要分为两类，你日常使用的以 类为主：

双抗体夹心 ELISA 试剂盒：适用于检测细胞因子、抗体、重组蛋白等大分子物质，也是细胞培养上清样本检测的金标准方案，特异性强、灵敏度高、可精准定量；

竞争法 ELISA 试剂盒：适用于检测激素、小分子多肽等分子量过小、无法同时结合两个抗体的物质，通过竞争结合的模式实现定量。

ELISA 试剂盒之所以成为你这类细胞实验样本检测的 工具，核心优势在于：灵敏度极高，通过酶促信号放大可检测到 pg/mL 级别的微量目标物，完全适配细胞培养上清中低丰度细胞因子的检测；特异性极强，基于抗原 - 抗体的特异性结合，可精准识别目标物，几乎不受样本中其他蛋白的干扰；操作简便、通量高，预制体系无需自行优化，可同时检测数十个样本，适配批量细胞孔样本的检测需求；可实现 定量，通过标准品可精准换算出样本中目标物的具体浓度，而非仅定性判断阴阳，完全匹配你验证样本浓度是否符合冻存要求、合并后样本均一性的实验需求。

ELISA（酶联免疫吸附测定，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）的核心原理是：抗原与抗体的特异性免疫反应 + 酶催化底物的化学显色反应，通过颜色深浅定量 / 定性判断样本中待测物浓度。

试剂盒的组成

ELISA 试剂盒标准操作流程（双抗体夹心法为例）

所有操作需严格遵循试剂盒说明书，以下为通用标准化流程，含核心操作要点：

实验前准备

提前 1 小时将试剂盒所有组分从冰箱取出，室温（20-25℃）避光平衡至室温，酶结合物、标准品需避免阳光直射，冻干标准品需按说明书精准复溶、静置。

提前开启酶标仪、洗板机，完成校准；配制工作液：浓缩洗涤液用纯水稀释至工作浓度，底物 A/B 液按 1:1 比例临用前新鲜混合。

确定实验布局，提前规划标准品梯度、空白对照、阴性对照、样本重复孔的位置，避免加样错误。

样本前处理

血清、血浆、细胞培养上清、组织匀浆等样本，需按说明书要求离心、稀释，去除沉淀、脂质、溶血杂质，降低基质效应；待测浓度超出线性范围的样本，需用样本稀释液梯度稀释后再检测。

加样与孵育

按布局，向对应孔中加入标准品梯度液、待测样本、对照品，每孔加样体积精准一致，加样时避免枪头触碰孔壁、产生气泡，加样完成后用封板膜严密封口。

按说明书要求，37℃恒温避光孵育，孵育时间严格遵守说明书，不可随意延长或缩短，孵育时避免封板膜翘起、液体蒸发。

洗板（核心关键步骤）

孵育结束后，快速甩去孔内液体，在吸水纸上 拍干残留液体，按说明书要求用洗涤液洗板 3-6 次，每次洗板需注满孔、静置 30 秒后甩干，确保洗板充分，去除未结合的游离物质。

洗板不 会导致本底飙升、结果偏差，洗板过度会导致复合物脱落、信号偏低。

加酶结合物与二次孵育

每孔加入精准体积的酶结合物工作液，封板膜密封后，按说明书 37℃恒温避光孵育，严格控制孵育时间。

二次洗板

重复洗板操作，洗板次数、参数严格按说明书执行，洗板完成后 拍干孔内残留液体，无可见液滴。

底物显色

每孔加入新鲜混合的底物工作液，轻轻混匀后，37℃恒温避光孵育显色，严格控制显色时间，显色过程需避光，避免强光导致底物自发显色、本底升高。

终止反应与读数

按顺序每孔加入终止液，轻轻混匀后，蓝色产物会立即变为黄色，终止后 10-30 分钟内，用酶标仪读取 450nm 处的 OD 值，必要时设置参比波长 630nm，降低孔间误差。

数据处理

以标准品浓度为横坐标，对应 OD 值为纵坐标，拟合四参数 Logistic 曲线（优先选择）或线性回归曲线，根据样本 OD 值，计算出样本中待测靶标的浓度，结合稀释倍数换算最终结果。

实验步骤

1. 试剂准备：实验前将所有试剂盒组分及样本恢复至室温（25℃左右），浓缩洗涤液用蒸馏水稀释至1×工作液，浓缩检测抗体、链霉亲和素-HRP按说明书比例用样本稀释液稀释至工作液，现配现用。

2. 加样：根据实验需求确定所需板条数量，空白孔加入50μL样本稀释液，标准品孔加入50μL不同浓度的标准品工作液，待测样本孔加入50μL处理后的样本（已稀释的样本直接加入，未稀释样本可根据情况用样本稀释液1:1稀释后加入）；随后向所有孔中加入50μL生物素标记检测抗体工作液，轻轻振荡混匀。

3. 孵育：盖上封板膜，置于37℃恒温箱中孵育60分钟。

4. 洗涤：小心揭开封板膜，甩去孔内液体，每孔加满1×洗涤液，静置30秒后甩去，用吸水纸拍干；重复此洗涤步骤3次，若使用洗板机，洗涤次数可增加1次。

5. 加酶：每孔加入80μL链霉亲和素-HRP工作液，轻轻振荡混匀，盖上封板膜，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤：重复步骤4的洗涤操作， 去除未结合的酶结合物。

7. 显色：每孔依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，轻轻振荡混匀，盖上封板膜，37℃避光孵育10分钟，此时阳性孔会逐渐呈现蓝色。

8. 终止：取出酶标板，迅速向每孔加入50μL终止液，轻轻振荡混匀，蓝色会立即转为黄色。

9. 检测：加入终止液后10分钟内，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的OD值（若需校正，可在630nm波长处测定参考OD值，最终检测OD值=450nm OD值-630nm OD值）。

ELISA 试剂盒核心性能评价指标

这是判断试剂盒质量、是否满足实验要求的核心标准，也是试剂盒研发、稳定性验证的核心依据，呼应你之前关注的加速稳定性实验：

灵敏度：分为 检出限（LOD）和定量下限（LLOQ），LOD 是可检出靶标的 浓度，LLOQ 是可精准定量的 浓度，数值越低，试剂盒的检测能力越强。

特异性：通过交叉反应率评估，试剂盒与靶标结构类似物的交叉反应率越低，特异性越强，检测结果越准确，无假阳性干扰。

精密度：用变异系数（CV）评估，分为板内精密度（同一块板同一样本重复孔 CV≤10%）、板间精密度（同批次不同板同一样本 CV≤15%）、批间精密度（不同批次试剂盒同一样本 CV≤20%），CV 越低，重复性越好。

准确度：用加标回收率评估，向空白基质中加入已知浓度的标准品，检测回收率需在 80%-120% 之间，越接近 ，定量准确性越高。

线性范围：试剂盒可精准定量的靶标浓度区间，实验中样本浓度需落在该区间内，超出范围需稀释后检测。

稳定性：是试剂盒有效期标定的核心，分为 4 类，也是你之前关注的加速稳定性实验的核心应用场景：

实时稳定性：试剂盒在规定保存条件下，长期存放的性能稳定性，是有效期标定的金标准。

加速稳定性：37℃恒温放置 7-14 天，模拟长期保存的老化效果，快速预判试剂盒有效期。

开瓶稳定性：试剂盒开封后，按规定条件存放的性能稳定性，指导开封后的使用时限。

运输稳定性：模拟运输过程中的温度波动、震动等条件，验证试剂盒的运输耐受性。

结果计算

1. 首先计算每个标准品、空白孔及样本孔的平均OD值（复孔检测时），空白孔OD值作为阴性对照，用于扣除背景干扰。

2. 以标准品浓度为横坐标（X轴，对数坐标），对应的OD值为纵坐标（Y轴，线性坐标），使用专业绘图软件（如Excel、GraphPad Prism）绘制标准曲线，计算回归方程（R2值应≥0.99，确保标准曲线的可靠性）。

3. 将扣除背景后的样本OD值代入回归方程，计算出样本中[检测指标]的初步浓度，再根据样本的稀释倍数计算出样本的实际浓度。

试剂准备的注意事项

1.所有试剂按说明书指定温度保存（2–8℃ 或 -20℃）

2.避免阳光直射，酶结合物、底物需避光

3.不同批号试剂不可混用

4.加样前检查试剂是否浑浊、沉淀、变色，异常则弃用

5.所有试剂开盖后尽快使用，剩余按要求保存

售后服务

上海笃玛生物科技有限公司拥有专业的技术服务团队，为您提供全程技术支持。如您在产品使用过程中有任何疑问，或对产品质量有异议，请及时联系我们的技术顾问，我们将在24小时内响应，为您提供实验方案优化、问题排查等专业服务。