人（Human）CITH3-DNA复合物（CITH3-DNA）ELISA检测试剂盒

【产品货号】DM-H154

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【注意事项】

实验前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行。

所有试剂需在有效期内使用，不同批次的试剂不得混用。

操作时需戴手套、口罩，避免试剂接触皮肤和黏膜。

TMB底物溶液有潜在致癌性，终止液为强酸，操作时需小心，若不慎接触，立即用大量清水冲洗。

实验结束后，废弃物应按照生物安全规定处理。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

ELISA 判断洗板是否干净：分定性肉眼初判、实验结果判断、空白对照质控判断三级，同时区分 “洗不干净” 和别的干扰因素

一、肉眼观察（只能初步筛查，不能作为最终判定依据）
1. 观察孔内：洗完吸液 / 甩板之后，孔内无浑浊、无絮状物、无蛋白沉淀，没有肉眼可见的残留污渍；洗液清亮。
局限：很多游离酶标记物是无色的，肉眼看不见，肉眼干净≠洗干净。只能看有没有颗粒、结晶、纤维杂质。
2. 看板框：孔口、板边框没有黄色 / 有色污渍（如果是显色前，这条不适用）；无大量液滴堆积。

二、最核心：对照孔数据判定（实验 方法）
空白孔（Blank）
空白孔不加样本、不加一抗 / 二抗，只参与整套孵育和洗板流程。
洗板合格：空白 OD 很低，一般接近仪器本底（如＜0.1，依试剂盒而定）
洗板不干净：空白 OD 明显偏高。代表游离酶标物没有洗净，残留的酶后续催化底物显色，整体本底抬高。
2. 阴性对照孔（NC）
加入阴性样本，不含待测抗原 / 抗体。
合格：阴性 OD 低，和空白孔接近
洗板不足：阴性孔 OD 异常升高（假阳性），多是游离酶标二抗残留。
注意：阴性孔偏高不一定全是洗板问题，还可能是封闭不足、样本基质干扰、异嗜性抗体，需要和空白孔联合判断。
3. 阳性对照孔（PC）
若阳性信号明显jiang低：大概率洗涤过度（Tween 过高、洗次数过多、浸泡太久，特异性抗原抗体复合物被洗脱），不是洗不干净。
简单区分逻辑
空白孔升高 → 优先怀疑洗板不充分（游离酶标二抗残留）
阳性孔信号下降，空白正常 → 洗涤过度，特异性复合物解离

三、辅助验证方法（怀疑洗板效果时做验证实验）
1. 梯度洗涤试验（金标准）
同一板，分多组，固定其他条件，设置不同洗涤次数（3 次、4 次、5 次、6 次），其余条件完全一致。
随着洗涤次数增加，空白 OD 持续下降，到某一次后空白不再继续降低，信号基本稳定，这个次数就是充分洗涤；继续增加洗涤，阳性信号开始下降 = 洗涤过头。
2. 残留标记物验证
酶标二抗孵育完成后，不同洗板条件， 一次洗完，直接加底物。
如果空白组显色很深，说明孔内残留大量游离酶标物，洗板不 。

四、洗板不干净常见现象（结合孔间差异）
1. 整块板背景普遍偏高，所有孔底色都深：最典型，游离酶标二抗没有洗干净，浸泡不足或次数不够。
2. 部分孔局部斑点状深色：不是整体洗不干净，多是纤维杂质、气泡残留、针堵（洗板机）。
3. 平行孔 CV 很大：不一定是洗不干净，多是孔间残液不一致（手工洗板最常见）。

五、容易混淆的误区
1. 空白高就一定是洗板问题：封闭不好、洗液 Tween 过低、孵育温度过高，同样会造成本底升高。
判断要点：做对照，更换洗液 / 封闭液，单独固定变量排查。
2. 洗越多越好：过度洗涤会解离抗原 - 抗体复合物，造成阳性信号下降。

简短总结（适合写实验报告）
不能仅依靠肉眼观察，空白孔 OD 值是判断洗板效果 指标。空白孔 OD 过高提示游离酶标记物残留，洗涤不充分；阳性对照信号明显jiang低提示洗涤过度。可设置洗涤梯度实验确定合适洗涤条件，区分洗板不足、洗涤过度以及非洗板因素带来的背景干扰。