产品货号：DM-H231

产品规格：96T / 48T

一、ELISA 检测原理

ELISA（酶联免疫吸附测定）核心是抗原 - 抗体特异性结合 + 酶促显色反应，通过颜色深浅反映待测物浓度。常用类型及原理：

1.双抗体夹心法（测大分子抗原 / 蛋白）固相包被捕获抗体 → 加入样本（待测抗原）→ 结合酶标检测抗体 → 加底物显色 → 吸光度与抗原浓度正相关。

2.间接法（测抗体）固相包被抗原 → 样本中待测抗体结合 → 加酶标二抗 → 底物显色 → 吸光度与抗体浓度正相关。

3.竞争法（测小分子抗原 / 半抗原）待测抗原与酶标抗原竞争结合有限抗体 → 待测物越多，显色越浅 → 吸光度与浓度负相关。

二、样本处理及要求

1.  血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.  血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.  组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。 将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.  细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

* 注：标本溶血会影响 检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

三、试剂盒的组成

四、标准品稀释方法

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。

2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。

3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。

4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。

5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

五、操作步骤

1.试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4.洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

六、结果计算

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32

对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]

建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

（此图仅供参考）

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

售后服务

上海笃玛生物科技有限公司拥有专业的技术服务团队，为您提供全程技术支持。如您在产品使用过程中有任何疑问，或对产品质量有异议，请及时联系我们的技术顾问，我们将在24小时内响应，为您提供实验方案优化、问题排查等专业服务。

笃玛实验小科普

先明确核心逻辑：温度波动会改变洗液黏度、软管弹性、气体溶解度，诱发管路气泡、泵输送体积漂移，直接破坏洗涤均一性，尤其基质效应评估这类高精度 ELISA 实验，必须管控洗板机本体、洗液、周边环境三者温度同步稳定。

首先控制实验室整体环境基础条件。洗板机摆放位置远离所有热源与冷源，避开空调出风口、恒温箱外壁、阳光直射窗口、门窗缝隙。空调不要直吹设备板面，气流直吹会造成设备局部快速降温升温。规划独立实验区域，尽量减少人员频繁进出带来的气流扰动；避免设备紧邻水浴、烘箱等产热仪器。条件允许时，将洗板机安置在恒温实验间，设定温度区间 20～25℃，温度波动幅度控制在 ±1℃以内。

其次做好设备自身散热管理。洗板机背部、两侧通风口预留足够空隙，不要堆放试剂盒、纸箱阻挡散热。设备持续长时间运行会产生积热，机身温度缓慢上升；连续开展多板检测时，预留合理间歇。不要在设备台面放置热源，禁止将刚从孵箱取出的热微孔板长时间搁置在洗板机平台上，持续传导热量改变设备局部温度。

然后管控洗液温度，这是极易忽略的关键点。洗液提前放置在洗板机所在实验环境平衡温度，平衡时间不少于 2 小时，严禁直接使用冷藏洗液上机。冷热洗液进入管路，一方面黏度突变影响输送精度，另一方面低温液体升温会释放溶解气体，大量生成气泡。洗液瓶不要放置地面，地面温度常与台面存在温差，放置在同一台面恒温。洗液储存容器加盖，减少液体温度随环境快速变化，同时避免挥发造成缓冲盐浓度改变。

减少阶段性剧烈温度扰动。实验开始前，提前开启空调稳定环境至少 30 分钟，等待室温平稳再启动洗板机。不要在实验中途开关门窗、启停大功率设备。昼夜温差大的实验室，尽量安排同一批次 ELISA 样品集中在白天固定时间段检测，避免白天、夜间温差带来系统偏差。若实验室昼夜温差显著，夜间停机后，次日开机预留足够时间让设备、洗液同步回温，不要开机立刻开展正式实验。

优化操作时序降低温差影响。不要将洗液长期保存在管路内部过夜。停机后排空管路，防止管路内残留液体昼夜温差反复析出结晶与气泡。实验过程中尽量减少频繁打开设备外壳，外壳开启会改变内部管路温度。

配套监测手段用于持续确认。在洗板机旁、洗液瓶位置各放置一支微量温度计，持续记录温度。高精度实验，每次实验前后记录环境温度，一旦出现超出预设波动范围，暂停实验。也可以对比不同温度条件下空白板基线离散度，验证温度波动对洗涤一致性的影响。

补充应急方案与判断依据。如果无法改造恒温房间，可使用挡风板隔绝空调直吹；利用保温垫减少台面冷热传导。区分温度诱发的典型现象：早晚批次数据重复性变差、开机初期与运行一小时后加液精度出现差异、管路更容易析出气泡，优先怀疑温度波动。

额外关键提醒：不仅要保证温度数值稳定，还要追求**微孔板、洗液、洗板机管路环境三者温度保持一致**，三者之间形成温差，依旧会产生溶解气体析出、流体特性变化等问题。单纯室温恒定，但洗液温度和设备温度不一致，依然无法消除误差。