人（Human）I型胶原蛋白（ColⅠ）ELISA检测试剂盒

产品货号：DM-H232

产品规格：96T / 48T

一、ELISA 检测原理

ELISA（酶联免疫吸附测定）核心是抗原 - 抗体特异性结合 + 酶促显色反应，通过颜色深浅反映待测物浓度。常用类型及原理：

1.双抗体夹心法（测大分子抗原 / 蛋白）固相包被捕获抗体 → 加入样本（待测抗原）→ 结合酶标检测抗体 → 加底物显色 → 吸光度与抗原浓度正相关。

2.间接法（测抗体）固相包被抗原 → 样本中待测抗体结合 → 加酶标二抗 → 底物显色 → 吸光度与抗体浓度正相关。

3.竞争法（测小分子抗原 / 半抗原）待测抗原与酶标抗原竞争结合有限抗体 → 待测物越多，显色越浅 → 吸光度与浓度负相关。

二、样本处理及要求

1.  血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.  血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.  组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。 将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.  细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

* 注：标本溶血会影响 检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

三、试剂盒的组成

四、标准品稀释方法

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。

2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。

3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。

4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。

5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

五、操作步骤

1.试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4.洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

六、结果计算

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32

对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]

建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

（此图仅供参考）

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

售后服务

上海笃玛生物科技有限公司拥有专业的技术服务团队，为您提供全程技术支持。如您在产品使用过程中有任何疑问，或对产品质量有异议，请及时联系我们的技术顾问，我们将在24小时内响应，为您提供实验方案优化、问题排查等专业服务。

笃玛实验小科普

洗板机环境温度稳定控制方案

温度波动带来三大直接风险：洗液黏度改变影响泵输送精度、液体溶解气体析出产生管路气泡、塑料管路弹性变化造成密封性短期漂移，最终破坏洗涤均一性。管控目标不只是稳定室温，还要实现**环境空气、洗板机机身、洗涤液、微孔板四者温度趋于一致**。

先规划设备摆放，规避持续性气流与冷热冲击。洗板机远离空调出风口、排风扇、门窗缝隙、烘箱、水浴锅、冰箱散热面，杜绝直吹风造成局部温度骤升骤降。设备四周预留通风间隙，不要用纸箱、试剂盒堵塞散热口，防止设备长时间运行积热。避开阳光直射位置，光照持续辐照会造成板面局部升温。台面尽量选用导热均匀材质，不要紧贴冰冷墙面。若空调气流无法避开，可加装简易挡风隔板缓冲气流。

控制实验室整体温控运行策略。优先使用恒温恒湿实验室，设定 22～24℃，允许波动范围 ±1℃。普通实验室不要频繁启停空调，实验开始前至少提前 1 小时开启空调，待温度平稳后再启动洗板机开展实验。同一批次 ELISA 尽量集中在固定时段完成，避免跨昼夜检测，规避昼夜温差干扰。实验期间减少门窗开合，降低外界冷热空气流入。人员走动带来的气流扰动无法完全消除，尽量不在设备周边频繁穿行。

洗液温度同步平衡是极易忽视的重点。冷藏储存的洗涤液需要提前转移至洗板机所在台面平衡温度，平衡时长不少于 2 小时，严禁直接低温上机。洗液瓶加盖放置，不要直接接触地面，地面温度常低于台面。不允许将温热洗液直接接入管路，冷热液体接触管路会快速析出微气泡。更换新洗液批次时，保证新旧液体温度一致。实验结束尽量排空管路内残留洗液，避免管路内液体昼夜温差反复析出结晶与气体。

控制设备运行带来的自发热干扰。长时间连续多板洗涤，泵体持续工作会累积热量，机身温度缓慢上升。连续检测超过 2 小时，可以安排短暂间歇，让设备温度回落。不要把刚从孵育箱取出的高温微孔板长时间搁置在洗板机平台，持续热传导改变局部管路温度。实验过程非必要不打开洗板机外壳，外壳开启会打破内部管路的温度稳态。

建立温度监测与预警机制。在洗板机机身旁、洗液瓶侧边分别放置温度计，实时记录温度。高精度方法学验证、基质效应评估实验，每次实验起止登记温度。当短时间温度波动超过 ±1.5℃，建议暂停实验，等待环境重新稳定。可以通过空白板基线试验辅助验证温度影响，对比温度平稳期与温度波动阶段的孔间 CV，判断波动是否干扰洗涤效果。

补充低成本应急优化手段。没有恒温房间时，可使用保温围挡弱化环境扰动；冬季实验室低温时，不要直接使用冷洗液；夏季避免白天高温时段开展高精度定量实验。同时区分现象，开机前半小时数据波动较大，后续逐渐平稳，大概率是设备、洗液尚未达到环境热平衡。

明确一条实操准则：很多实验室只关注室温读数，忽略洗液与设备存在温差。即便室温数值稳定，洗液温度低于环境温度，液体进入管路升温，溶解气体持续析出，依旧会不断产生气泡，洗涤稳定性无法保障。