人（Human）III型胶原蛋白（Col III）ELISA检测试剂盒

产品货号：DM-H233

产品规格：96T / 48T

一、ELISA 检测原理

ELISA（酶联免疫吸附测定）核心是抗原 - 抗体特异性结合 + 酶促显色反应，通过颜色深浅反映待测物浓度。常用类型及原理：

1.双抗体夹心法（测大分子抗原 / 蛋白）固相包被捕获抗体 → 加入样本（待测抗原）→ 结合酶标检测抗体 → 加底物显色 → 吸光度与抗原浓度正相关。

2.间接法（测抗体）固相包被抗原 → 样本中待测抗体结合 → 加酶标二抗 → 底物显色 → 吸光度与抗体浓度正相关。

3.竞争法（测小分子抗原 / 半抗原）待测抗原与酶标抗原竞争结合有限抗体 → 待测物越多，显色越浅 → 吸光度与浓度负相关。

二、样本处理及要求

1.  血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.  血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.  组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。 将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.  细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

* 注：标本溶血会影响 检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

三、试剂盒的组成

四、标准品稀释方法

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。

2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。

3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。

4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。

5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

五、操作步骤

1.试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4.洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

六、结果计算

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32

对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]

建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

（此图仅供参考）

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1.酶标仪（450nm）

2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒温箱

售后服务

上海笃玛生物科技有限公司拥有专业的技术服务团队，为您提供全程技术支持。如您在产品使用过程中有任何疑问，或对产品质量有异议，请及时联系我们的技术顾问，我们将在24小时内响应，为您提供实验方案优化、问题排查等专业服务。

笃玛实验小科普

洗板机周边环境温度不稳定，一定会间接影响 ELISA 检测结果的准确性。影响程度随实验要求升高而放大，普通定性实验或许不容易明显察觉，但定量 ELISA、基质效应评估、方法学验证、弱阳性样本检测中，温度波动带来的误差极易造成数据失真，甚至得出错误实验结论。**

温度波动并不直接改变抗原抗体结合，而是通过改变洗板系统流体状态、洗涤动力学，造成**洗涤条件不一致**，最终引入误差，可以分为随机误差与潜在系统误差两类。

一、如何通过洗板环节干扰检测结果

温度起伏首先作用于洗液与管路系统，衍生一系列连锁问题。温度变化改变洗涤液黏度与硅胶管路弹性，泵每冲程输送液体体积发生漂移，出现加液量不均；负压管路密封性能短期波动，吸液残留量孔与孔之间不一致。同等洗涤程序下，部分孔洗涤充分、部分孔洗涤不足，非特异性结合去除程度不同，直接造成背景 OD 高低无序波动。

温度变化会改变液体溶解气体容量。低温洗液进入温度更高的管路，溶解气体持续析出形成管路气泡，产生间歇性气栓。气泡带来随机的洗涤盲区，同一板内随机出现异常孔，复孔变异系数上升。单纯执行管路排气只能短暂改善，温度持续波动会不断生成新气泡，无法 消除干扰。

温差改变洗涤动力学。低温环境下分子扩散速率下降，游离酶标抗体、杂蛋白从固相表面扩散进入液相的速度变慢，同等浸泡时间洗涤效果变差，本底升高；温度偏高时，弱亲和力的特异性免疫复合物更容易被洗脱，信号整体降低。当实验过程温度持续变化，相当于前半板和后半板有效洗涤强度不一致。

长期反复温度波动会加速管路盐结晶、生物膜沉积，管路流体阻力慢慢改变，造成不同日期、不同批次实验洗板性能逐步漂移，带来批间差异。

二、对不同类型 ELISA 造成的典型结果偏差

夹心 ELISA：洗涤不足导致背景升高，信噪比下降，弱阳性样本容易误判为阳性；部分孔信号异常降低，出现假阴性，复孔离散明显。
竞争 ELISA：基线本底漂移直接压缩有效检测窗口，标准曲线斜率不稳定，样本浓度计算偏差变大。
定量实验与基质效应研究（重点关注场景）：温度诱发的洗涤波动会产生叠加误差，研究者很难区分数据漂移来源于样本基质本身，还是洗板条件不稳定，直接干扰回收率试验、平行稀释线性评价，造成方法学验证结论不可靠。

三、容易混淆的关键边界

温度波动带来的大多是随机误差，表现为同一块板内部孔间重复性变差、出现无规律跳孔；如果昼夜温差巨大，上午与下午分开测板，还会叠加形成系统性批间偏移。
这类误差无法依靠复孔均值完全抵消，也不能通过空白孔、质控样本进行数学校正。
肉眼不一定能直观看到明显异常，很多时候只是 CV 小幅上升、标准曲线 R² 轻微下降，容易被当成正常实验波动忽略。

四、简易判断依据

出现下面现象，需要优先排查洗板区域温度稳定性：
空白板基线试验孔间 CV 时高时低；
管路排气后短时间内再次频繁出现水流间断、气泡；
同一套方案，上午、下午重复实验数据重复性差距明显；
弱阳性样本检测结果波动很大，无法稳定重复。

五、实操底线建议

常规定量实验建议洗板区域温度控制 20～25℃，波动控制 ±1℃以内；开展基质效应评估、方法学验证等高要求实验，洗液、微孔板、洗板机环境三者充分热平衡，尽量避免跨昼夜、温差大的时段开展检测。