人（Human）甲胎蛋白（AFP）ELISA检测试剂盒

产品货号：DM-H236

产品规格：96T / 48T

一、ELISA 检测原理

ELISA（酶联免疫吸附测定）核心是抗原 - 抗体特异性结合 + 酶促显色反应，通过颜色深浅反映待测物浓度。常用类型及原理：

1.双抗体夹心法（测大分子抗原 / 蛋白）固相包被捕获抗体 → 加入样本（待测抗原）→ 结合酶标检测抗体 → 加底物显色 → 吸光度与抗原浓度正相关。

2.间接法（测抗体）固相包被抗原 → 样本中待测抗体结合 → 加酶标二抗 → 底物显色 → 吸光度与抗体浓度正相关。

3.竞争法（测小分子抗原 / 半抗原）待测抗原与酶标抗原竞争结合有限抗体 → 待测物越多，显色越浅 → 吸光度与浓度负相关。

二、样本处理及要求

1.  血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.  血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

三、试剂盒的组成

四、标准品稀释方法

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。

2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。

3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。

4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。

5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

五、操作步骤

1.试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4.洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

六、结果计算

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

（此图仅供参考）

笃玛实验小科普

如何消除样本基质对实验的干扰？

消除基质干扰没有通用办法，需要先通过梯度稀释、平行性、加标回收确认干扰类型，再根据干扰物是大分子蛋白、小分子物质、脂质、溶血组分，选择对应的处理手段。稀释只能降di干扰wu浓度，多数情况无法完全消除基质效应，仅可作为临时妥协方案。
稀释法是 的手段，通过增大稀释倍数，降低样本中干扰组分的相对占比。适用场景是弱程度的基质抑制或增强。局限在于过度稀释会让待测物落到定量下限附近，检测变异变大，灵敏度丢失。如果平行性本身就不达标，单纯稀释不能修复曲线平行，只是让回收率看起来接近合格，结果依然存在系统偏差，不能用于准确定量。
基质匹配法，用空白样本基质来配制标准品，而不是试剂盒配套缓冲液。取不含待测物的同源空白样本，经过和待测样本一样前处理，用来稀释标准品，让标准品和待测样本处在相同基质环境下，抵消基质带来的增强或者抑制。这个方法适合 ELISA、发光免疫检测。难点在于很难获得完全空白的同源基质，血清样本尽量选择确认阴性的混合血清，细胞上清需要收集阴性细胞培养上清。注意空白基质本身不能含有目标待测物，否则标准曲线整体偏移。
样本前处理去除干扰物。透析适合小分子干扰物，像胆红素、部分脂类、小分子抑制因子，使用合适截留分子量的透析袋，缓冲液充分置换，去除小分子，大分子待测抗原可以保留。缺点操作耗时，部分蛋白会有吸附损失，低丰度样本不适合。超速离心适合脂质、脂蛋白干扰，血清样本高脂造成浊度、非特异性结合，高速离心去除乳糜微粒，吸取下层澄清样本，消除脂质带来的非特异性吸附。沉淀萃取，有机溶剂或者盐析沉淀去除部分干扰蛋白，注意条件摸索，避免目标抗原共沉淀丢失。针对溶血样本，血红蛋白释放会干扰免疫反应，高速离心去除红细胞碎片，严重溶血样本优先直接舍弃。
亲和或者固相萃取，利用抗原抗体、固相填料捕获目标分子，把样本基质组分流穿去除，之后再洗脱到缓冲液体系内。适合基质复杂的组织匀浆、体液样本，可以大幅度降低基质干扰，缺点会有目标物损失，需要做回收率验证。
改变检测体系条件，优化试剂盒反应条件，属于方法层面优化。调整孵育时间、温度，调整缓冲液 pH、离子强度，添加封闭蛋白，比如 BSA、酪蛋白，加入去干扰添加剂，部分体系会添加聚乙二醇、特定去污剂，降低基质蛋白非特异性吸附。这个需要方法学优化，普通使用者无法修改商品化试剂盒试剂，更多用于自建实验方法。
样本稀释液改良，在试剂盒稀释缓冲液基础上补充封闭剂，降低基质蛋白的非特异性吸附。不能解决强基质效应，只适合轻微干扰。
样本取舍，严重干扰样本，经过稀释、前处理、基质匹配之后，平行性依旧不达标，还原浓度离散，加标回收持续不合格，最稳妥方案就是舍弃该样本，重新采集样本。
不同干扰类型优先选择的策略，小分子类干扰，胆红素、药物、代谢物，优先透析，也可以适度稀释。脂质乳糜干扰，优先超速离心。大分子异质蛋白、免疫复合物干扰，优先基质匹配，固相萃取。强基质，多种干扰物共存，稀释仅能改善回收率，平行不能恢复，要使用前处理结合基质匹配。
重要的验证环节，无论使用哪一种消除手段，处理完成后必须重新做梯度稀释试验、平行性试验以及加标回收，确认回收率回到合格区间，样本稀释曲线和标准曲线平行，才证明基质干扰被有效控制。很多时候前处理会造成待测物损失，不能只看是否消除干扰，同时要评估目标物质的回收率。
还要区分误区，不要单纯依靠稀释就判定干扰已经消除。稀释只能降低干扰物占比，如果基质和待测抗原共存在，曲线不平行的问题不会消失。前处理之后不做方法学验证，很容易引入新偏差。基质匹配不能使用异源基质，比如细胞上清样本用血清做基质，反而引入新干扰。

判断样本基质是否干扰抗原‑抗体反应，不能只看单一回收率数值，要结合回收率变化趋势、线性、稀释平行性，同时区分钩状效应和基质干扰。基质干扰本质是样本里除待测抗原以外的组分，增强或者抑制抗原抗体结合，即便待测抗原本身没有问题，检测结果依旧会偏移。
首先观察稀释回收率的变化模式。如果随着稀释倍数不断加大，回收率出现持续单向漂移，就是基质干扰重要信号。一种是整体持续偏高，低倍、高倍稀释的回收率全部高于上限，而且越稀释，回收率逐步向正常值回落，提示基质存在增 应。另一种是整体持续偏低，各个稀释梯度回收率普遍低于合格范围，随稀释加大回收率慢慢回升，属于基质抑制效应。这里要区分钩状效应，钩状效应只出现在低稀释点，高稀释梯度的回收率可以直接回到合格区间，不会全梯度系统性偏移。如果仅仅个别稀释点偏离，其余点全部正常，一般属于移液操作误差，不属于基质干扰。要注意，即使平均回收率落在合格区间，但数据是持续上升或者持续下降，依旧判定存在基质干扰。
看稀释系列的线性与斜率。以理论浓度为 X，实测浓度为 Y 做回归。相关系数 R² 良好，只能说明信号和稀释倍数成比例，不能排除基质干扰。重点看回归斜率，如果斜率显著大于 1，代表检测结果系统性偏高，斜率明显小于 1，代表结果系统性偏低。R² 很好但斜率偏离 1，说明基质带来恒定的增强或者抑制，每一个稀释点都受到基质的同等程度影响，这种干扰很容易被忽略。
第三是平行性比对，这是判定基质干扰最关键的证据。把标准品用试剂盒配套稀释液进行梯度稀释，待测样本用完全相同的稀释液做梯度稀释，以 log 浓度为横轴，log 信号值为纵轴分别拟合曲线。若两条曲线斜率差异明显，曲线不平行，基本可以判定存在基质干扰。样本中基质成分会改变抗原抗体的结合动力学，造成同样的抗原浓度下，反应信号和标准品体系不一样。即便稀释回收率看起来尚可，只要平行性不满足，样本的检测结果就不可靠。抗原本身异质性也会造成不平行，但临床生物样本更多来源于基质干扰。
第四结合信号与浓度的逻辑来辅助判断。如果把样本稀释之后，还原出来的浓度不收敛到同一个数值。理想无干扰的样本，各个有效稀释梯度换算回原样本的还原浓度会互相接近。存在基质干扰时，不同稀释倍数算出来的原样本浓度离散度很大，各个梯度还原值分散，无法聚拢在一个区间。
第五结合对照实验进一步确证。可以做基质匹配加标回收试验，把已知量的标准品加到空白基质里，和单纯缓冲液中的标准品做对比。加标回收率偏离合格范围，直接证实基质存在抑制或者增强。也可以对样本做简单前处理，比如透析，去除小分子干扰物，处理之后再做梯度稀释，如果回收率和平行性得到ming显改shan，反向证明原先的偏移来自基质组分。
还要区分容易混淆的情况。样本降解也会造成结果异常，但样本降解之后，信号会整体性降低，不会表现出随稀释变化的漂移。钩状效应只发生高浓度端，高稀释梯度可以恢复正常，不会出现全梯度平行性破坏。操作误差只会造成个别点异常，不会带来系统性斜率偏移和曲线不平行。
总结判定逻辑，出现下面任意一项，提示存在基质干扰。回收率随稀释倍数单向漂移；线性回归 R² 合格，但斜率明显偏离 1；样本稀释曲线与标准品曲线不平行；不同稀释梯度得到的还原浓度离散，无法收敛；基质加标回收试验结果不合格。一旦确认基质干扰，单纯依靠进一步稀释并不能完全消除干扰，只能减弱干扰程度，需要透析、萃取或者使用基质匹配稀释液处理样本，不能直接用稀释换算的结果报告样本浓度。