人（Human）转谷氨酰胺酶（TGM2）ELISA检测试剂盒

产品货号：DM-H238

产品规格：96T / 48T

一、ELISA 检测原理

ELISA（酶联免疫吸附测定）核心是抗原 - 抗体特异性结合 + 酶促显色反应，通过颜色深浅反映待测物浓度。常用类型及原理：

1.双抗体夹心法（测大分子抗原 / 蛋白）固相包被捕获抗体 → 加入样本（待测抗原）→ 结合酶标检测抗体 → 加底物显色 → 吸光度与抗原浓度正相关。

2.间接法（测抗体）固相包被抗原 → 样本中待测抗体结合 → 加酶标二抗 → 底物显色 → 吸光度与抗体浓度正相关。

3.竞争法（测小分子抗原 / 半抗原）待测抗原与酶标抗原竞争结合有限抗体 → 待测物越多，显色越浅 → 吸光度与浓度负相关。

二、样本处理及要求

1.  血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.  血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.  组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。 将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.  细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

* 注：标本溶血会影响 检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

三、试剂盒的组成

四、标准品稀释方法

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。

2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。

3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。

4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。

5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

五、操作步骤

1.试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4.洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

六、结果计算

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

（此图仅供参考）

有哪些方法可以识别样本梯度稀释试验中的钩状效应？

钩状效应也就是 HOOK 效应，本质是高浓度抗原过量，免疫复合物形成受抑制，直接检测的信号偏低，造成浓度假性降低。在样本梯度稀释试验当中，可以通过数据趋势、还原浓度、回收率、信号‑浓度曲线、增设对照多个角度识别，要注意和基质干扰做好区分。
首先看稀释回收率的变化趋势，这是最直观的判断线索。未稀释或者低稀释倍数的样本，稀释回收率显著低于合格下限，随着稀释倍数不断加大，回收率逐步上升，到中高稀释梯度时回收率回到 80‑120% 合格区间。只有低稀释点异常，更高稀释梯度恢复正常，这是钩状效应典型特征。和基质干扰做区分，基质干扰大多是全梯度持续偏高或者偏低，整体单向漂移，不会高稀释梯度自动恢复正常。
观察还原浓度的变化。把每个稀释点换算回原样本的还原浓度，钩状效应样本会出现，低稀释倍数得到的还原浓度偏低，随着稀释加大，还原浓度逐步升高，到达某一个稀释倍数之后，还原浓度趋于稳定收敛在同一个数值区间。到达平台之后继续再稀释，还原浓度才会因为接近定量下限开始离散。原始未稀释样本读出的浓度，远低于稀释收敛之后得到的真实浓度。普通无干扰合格样本，各个梯度的还原浓度互相接近，不会出现明显上升过程。
第三看信号与读出浓度的背离。直接看 OD 或者发光信号，低稀释样本信号没有继续走高，出现信号拐点，样本浓度继续增加，但信号不再同步上升，甚至信号出现下降。标准品是浓度越高信号越强，发生钩状效应的高浓度样本，信号反而比中等稀释样本的信号高得不多，甚至更低。这里要注意，不能只看仪器报出来的浓度，一定要看原始信号，很多仪器会直接套用标准曲线计算，不会提示信号已经进入钩状区域。
第四结合线性回归的特征辅助识别。把理论浓度作为 X，实测浓度作为 Y，低稀释点会明显偏离回归直线，向下方偏移。去掉受钩状效应影响的低稀释点之后，剩余中高稀释梯度的 R² 立刻变好。如果是基质干扰，剔除个别点不会让线性突然改善，整体的斜率偏移会持续存在。
第五平行性分析辅助鉴别。发生钩状效应的是低浓度区间以外的高浓度端，把受钩状效应干扰的低稀释点剔除之后，剩余有效稀释点，样本稀释曲线和标准品曲线可以恢复平行。基质干扰即便剔除部分点，曲线依旧不平行，这是二者很关键的区分点。钩状效应是高浓度下抗原过量带来的反应抑制，不是样本基质组分改变抗原抗体结合特性，所以脱离过量区间之后平行性可以恢复。
第六增设验证实验确认怀疑的钩状效应。 种，样本稀释后复现实验，将样本做更高倍数稀释，如果检测得到换算后的原样本浓度明显高于原样本直接检测结果，提示钩状效应。 种，加标实验，向高浓度待测样本中再加入已知量标准抗原，如果信号几乎没有升高，说明体系已经处于抗原过量抑制状态；正常无钩状的样本，加入标准品信号应当出现对应升高。
实操中容易踩的误区，不要把钩状效应误判成基质抑制。基质抑制所有梯度都受影响，稀释后只是干扰被减弱，但不会出现明确收敛平台；钩状效应仅影响低稀释高浓度点，稀释到抗原不过量的区间，结果直接收敛稳定。另外不要把信号超过标准曲线上限等同于钩状效应，单纯超出标准曲线 点只是信号饱和，信号依旧随样本浓度升高而上升，钩状效应是浓度升高信号反而不升甚至下降。
总结识别要点，低稀释回收率偏低，稀释增大后回收率回升；还原浓度随稀释上升后收敛；高浓度样本信号不再随浓度升高而增加；剔除低稀释点后线性、平行性恢复，基本就可以判定存在钩状效应。确认钩状效应之后，不能使用未稀释或者低稀释的检测结果，应当选用已经脱离钩状效应、还原浓度收敛的稀释倍数作为正式检测工作稀释度。