人（Human）辅酶Q10（CoQ10）ELISA检测试剂盒

【产品货号】DM-H285

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【注意事项】

实验前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行。

所有试剂需在有效期内使用，不同批次的试剂不得混用。

操作时需戴手套、口罩，避免试剂接触皮肤和黏膜。

TMB底物溶液有潜在致癌性，终止液为强酸，操作时需小心，若不慎接触，立即用大量清水冲洗。

实验结束后，废弃物应按照生物安全规定处理。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

【笃玛实验服务代测】

ELISA（酶联免疫吸附实验）代测是科研和临床检测中最常用的外包服务之一，基于抗原抗体特异性结合原理，可对生物样本中的微量物质进行定量或定性检测。

一、按检测靶标类型分类

1. 细胞因子与趋化因子类

这是科研中需求量 的代测类别，主要用于免疫、炎zheng、肿liu、心xue管等研究

白细胞介素家族：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23 等

干扰素家族：IFN-α、IFN-β、IFN-γ

肿liu坏死因子家族：TNF-α、TNF-β、LTA

趋化因子家族：CCL2 (MCP-1)、CCL5 (RANTES)、CXCL8 (IL-8)、CXCL10 (IP-10)

生长因子家族：EGF、VEGF、FGF、PDGF、TGF-β、NGF、IGF-1

2. yan症与免疫相关标志物

急性期反应蛋白：CRP、SAA、PCT、纤维蛋白原

补体系统：C3、C4、C5a、C1q

免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgE、IgD 及各亚型

免疫细胞表面标志物：sCD4、sCD8、sCD14、sCD163

3. 激素与内fen泌相关

垂体激素：FSH、LH、TSH、GH、PRL、ACTH

甲状腺激素：T3、T4、FT3、FT4、TSH

性激素：雌二醇 (E2)、孕酮 (P)、睾酮 (T)、雌酮、脱氢表雄酮

代谢激素：胰岛素、胰高xue糖素、瘦素 (Leptin)、脂联素 (Adiponectin)、抵抗素

应激激素：皮质醇、肾上腺su、去甲肾上腺su

4. 肿liu标志物

广谱肿liu标志物：CEA、AFP、CA125、CA19-9、CA15-3、CA72-4

器官特异性标志物：PSA 、NSE、CYFRA21-1、SCC

肿liu相关蛋白：MMP-2、MMP-9、TIMP-1、VEGF、EGFR

5. 自身抗体类

抗核抗体谱：ANA、抗 ds-DNA、抗 Sm、抗 SSA、抗 SSB

类风shi相关：RF、抗 CCP、抗角蛋白抗体

血guan炎相关：ANCA (c-ANCA、p-ANCA)、抗内皮细胞抗体

其他自身抗体：抗甲状腺抗体 (TPOAb、TgAb)、抗胰岛素抗体、抗磷脂抗体

6. 心血guan疾bing相关标志物

心ji损伤标志物：cTnI、cTnT、CK-MB、Myoglobin

心功能标志物：BNP、NT-proBNP

动脉zhou样硬化标志物：ox-LDL、Lp-PLA2、hs-CRP、同型半胱氨酸

凝血与纤溶：D - 二聚体、FDP、PAI-1、t-PA

7. 神经科学相关

神经递质：5 - 羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺su、乙酰胆碱、γ- 氨基丁酸

神经退行性标志物：Aβ1-40、Aβ1-42、Tau 蛋白、磷酸化 Tau 蛋白

神jing炎zheng标志物：GFAP、S100B、NSE、MBP

8. 其他常见靶标

代谢物：葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、尿酸、肌酐

病原体抗原 / 抗体：乙gan五项、bing肝抗体、梅du抗体、HIV 抗体、 抗原 / 抗体

药物浓度：抗生素、化liao药物、免yi抑制剂血药浓度

多克隆抗体预吸附（预吸收）完整操作
区分两种常用场景：①固相填料批量预吸收（长期纯化抗体，去除识别杂蛋白的杂 IgG，适合 IHC/WB 高背景多抗）；②溶液内抗原预孵育（多用于特异性对照验证，不适合长期除杂抗体）
原理：用不含靶抗原的杂蛋白 / 固定化杂抗原，先结合多抗中交叉反应的杂抗体，离心 / 过柱去除复合物，上清即为预吸附后抗体
方案 A：固相吸附剂批量预吸附（推荐，可长期保存处理后的抗体）
一、试剂与材料准备
待处理：粗制抗血清 / Protein A/G 纯化后的多抗 IgG
吸附原料：不含靶抗原的同源组织裂解液、正常血清、抗原阴性细胞（根据样本来源选择，如做小鼠组织 IHC，用小鼠正常血清 / 靶基因敲除小鼠组织裂解）
交联试剂：0.25% 戊二醛（制备固相凝胶吸附剂）；或商用 CNBr 活化 Sepharose 4B
缓冲液：PBS/TBS（pH7.2–7.4）；3M KSCN（填料再生洗脱）
耗材：低温离心机、翻转摇床、层析柱、0.22μm 滤器
二、固相吸附凝胶制备（自制吸附填料）
杂抗原溶液（正常血清 / 组织上清）用 PBS 等倍稀释
加入终浓度 0.25% 戊二醛，4℃过夜交联形成凝胶
打碎凝胶颗粒，大量 PBS 反复洗涤，去除游离戊二醛与未交联蛋白
凝胶沉淀备用，可 4℃短期保存；使用前用 TBS 平衡 3 次
简化替代：直接购买已交联杂蛋白的琼脂糖微球，跳过交联步骤
三、抗体预吸附操作
抗体预处理：抗血清 4℃ 12000g 离心 15 min，去除沉淀，避免聚集干扰；可用 TBS 适当稀释
按体积比例加入固相吸附凝胶：抗体：凝胶 ≈ 10:1，充分重悬
4℃翻转摇床孵育 2–4 h，或过夜（杂抗体多建议过夜）
低速离心（3000–500g，5 min），小心吸取上清，不要吸到凝胶沉淀
可选二次吸附：上清更换新鲜吸附凝胶，重复孵育离心，进一步去除残留杂抗体
上清用 0.22μm 滤膜过滤除菌，分装，-80℃保存，避免反复冻融
验证：平行做未处理 / 预吸附后抗体对比 WB 或 IHC，观察背景下降效果
四、填料再生（可重复使用）
凝胶加入 3M 硫氰酸钾，室温孵育 30 min 洗脱杂抗体，大量 TBS 充分洗涤至中性，4℃保存备用
方案 B：抗原阴性细胞预吸附（适合细胞样本多抗）
收集靶抗原敲除 / 不表达靶抗原的细胞，PBS 洗涤，500g 离心 5 min 收集沉淀
2% 多聚甲醛冰上固定 15–30 min，冰 PBS 洗涤 2 次
0.2% 皂素透化 15 min，冰 PBS 洗涤 3 次， 弃上清
加入待处理抗血清，重悬细胞沉淀
4℃旋转孵育 60–120 min
离心沉淀细胞，收集上清即为预吸附抗体；必要时重复一轮吸附提高净化效果Perelman S...
方案 C：溶液内抗原预孵育（多用于特异性对照，不适合长期除杂抗体）
注意：该方法常用来做阻断对照验证特异性，不能去除全部杂抗体，仅消耗识别靶抗原的特异性抗体，不要和固相预吸收混淆
先确定抗体 工作稀释度
抗体工作液中加入 5–10 倍摩尔过量的重组靶蛋白 / 免疫肽段
轻柔混匀，室温 1–2 h 或 4℃过夜旋转孵育
12000–14000g 离心 10–15 min，去除抗原 - 抗体复合物沉淀，取上清直接用于实验
设置对照：同等抗体 + 等量无关蛋白、单纯抗体稀释液，平行实验对比信号消失情况
✅ 关键注意事项
缓冲液优先 TBS，高盐（0.15–0.5M NaCl）可降低静电非特异；尽量避免高浓度去污剂，防止抗原从固相填料上脱落
全程低温 4℃操作，防止抗体变性失活；不要剧烈涡旋
预吸附会轻微降低特异性信号强度，后续需要重新滴定抗体工作浓度，平衡信噪比
质控必须设置平行对照：原始未处理抗体、预吸附后抗体，对比背景与特异信号
适用边界：如果非特异来自 Fc 段吸附载体，优先 Protein A/G 纯化；Fab 交叉反应（多抗特有）才优先做预吸附
❌ 常见失败原因
吸附填料不足、孵育时间太短 → 杂抗体去除不充分，背景下降不明显
离心吸取上清带入固相凝胶颗粒 → 出现沉淀、斑点杂信号
戊二醛交联不足，杂抗原脱落，污染抗体
反复冻融预吸附后的抗体，IgG 聚集，背景反弹