人（Human）Tau蛋白（Tau）ELISA检测试剂盒

【产品货号】DM-H287

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【注意事项】

实验前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行。

所有试剂需在有效期内使用，不同批次的试剂不得混用。

操作时需戴手套、口罩，避免试剂接触皮肤和黏膜。

TMB底物溶液有潜在致癌性，终止液为强酸，操作时需小心，若不慎接触，立即用大量清水冲洗。

实验结束后，废弃物应按照生物安全规定处理。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

【笃玛实验服务代测】

ELISA（酶联免疫吸附实验）代测是科研和临床检测中最常用的外包服务之一，基于抗原抗体特异性结合原理，可对生物样本中的微量物质进行定量或定性检测。

一、按检测靶标类型分类

1. 细胞因子与趋化因子类

这是科研中需求量 的代测类别，主要用于免疫、炎zheng、肿liu、心xue管等研究

白细胞介素家族：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23 等

干扰素家族：IFN-α、IFN-β、IFN-γ

肿liu坏死因子家族：TNF-α、TNF-β、LTA

趋化因子家族：CCL2 (MCP-1)、CCL5 (RANTES)、CXCL8 (IL-8)、CXCL10 (IP-10)

生长因子家族：EGF、VEGF、FGF、PDGF、TGF-β、NGF、IGF-1

2. yan症与免疫相关标志物

急性期反应蛋白：CRP、SAA、PCT、纤维蛋白原

补体系统：C3、C4、C5a、C1q

免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgE、IgD 及各亚型

免疫细胞表面标志物：sCD4、sCD8、sCD14、sCD163

3. 激素与内fen泌相关

垂体激素：FSH、LH、TSH、GH、PRL、ACTH

甲状腺激素：T3、T4、FT3、FT4、TSH

性激素：雌二醇 (E2)、孕酮 (P)、睾酮 (T)、雌酮、脱氢表雄酮

代谢激素：胰岛素、胰高xue糖素、瘦素 (Leptin)、脂联素 (Adiponectin)、抵抗素

应激激素：皮质醇、肾上腺su、去甲肾上腺su

4. 肿liu标志物

广谱肿liu标志物：CEA、AFP、CA125、CA19-9、CA15-3、CA72-4

器官特异性标志物：PSA 、NSE、CYFRA21-1、SCC

肿liu相关蛋白：MMP-2、MMP-9、TIMP-1、VEGF、EGFR

5. 自身抗体类

抗核抗体谱：ANA、抗 ds-DNA、抗 Sm、抗 SSA、抗 SSB

类风shi相关：RF、抗 CCP、抗角蛋白抗体

血guan炎相关：ANCA (c-ANCA、p-ANCA)、抗内皮细胞抗体

其他自身抗体：抗甲状腺抗体 (TPOAb、TgAb)、抗胰岛素抗体、抗磷脂抗体

6. 心血guan疾bing相关标志物

心ji损伤标志物：cTnI、cTnT、CK-MB、Myoglobin

心功能标志物：BNP、NT-proBNP

动脉zhou样硬化标志物：ox-LDL、Lp-PLA2、hs-CRP、同型半胱氨酸

凝血与纤溶：D - 二聚体、FDP、PAI-1、t-PA

7. 神经科学相关

神经递质：5 - 羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺su、乙酰胆碱、γ- 氨基丁酸

神经退行性标志物：Aβ1-40、Aβ1-42、Tau 蛋白、磷酸化 Tau 蛋白

神jing炎zheng标志物：GFAP、S100B、NSE、MBP

8. 其他常见靶标

代谢物：葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、尿酸、肌酐

病原体抗原 / 抗体：乙gan五项、bing肝抗体、梅du抗体、HIV 抗体、 抗原 / 抗体

药物浓度：抗生素、化liao药物、免yi抑制剂血药浓度

非变性间接 ELISA 封闭液选择核心注意事项
封闭的本质：占据酶标板聚苯乙烯表面未结合抗原的疏水空白位点，阻止后续一抗、二抗被动吸附产生背景。非变性体系 约束：封闭组分不能破坏包被抗原天然构象，不能干扰抗原 - 抗体特异性结合，不能引入可被二抗识别的异源蛋白。下面分选型要点、常用封闭液优缺点、禁忌、优化判定要点整理。
一、通用选型注意事项
避免引入交叉反应蛋白（重中之重）
二抗一般是抗一抗宿主物种 IgG。例如一抗是兔源多抗，二抗是羊抗兔 IgG，就不能使用兔血清、兔 IgG 作为封闭组分，否则二抗直接结合封闭蛋白，整体背景大幅升高。
封闭蛋白的物种来源尽量和一抗、二抗来源错开。
不可使用强变性组分
不能添加 SDS、高浓度去垢剂、高浓度尿素、盐酸胍等变性试剂，会导致包被天然抗原解折叠、空间表位丢失，造成阳性信号下降甚至假阴性。
控制封闭蛋白浓度，避免过量
浓度过低：封闭不完全，空白背景高；
浓度过高：蛋白多层吸附、松散结合，洗涤时脱落，反而抬高背景，还可能产生空间位阻阻碍一抗结合固相抗原。常规工作区间：0.5%～2%（w/v）。
封闭液缓冲体系尽量和包被、一抗稀释液兼容
pH、离子强度尽量接近后续一抗工作液，防止封闭完成后洗板出现 pH 突变，诱发抗原构象改变或蛋白解离。常用 pH7.2–7.4 PBS/TBS 作为封闭液基底。
留意添加剂的影响
Tween-20：封闭液中一般不加或极低浓度添加；高 Tween 会洗脱天然抗原，不建议直接照搬常规 ELISA 配方。
防腐剂：叠氮钠、ProClin 按需添加；HRP 体系避开叠氮钠。
甘油、蔗糖：可少量用于蛋白稳定，但过高黏度会造成封闭不均、孔间 CV 变大。
EDTA：仅在金属交联背景高时评估，金属依赖构象抗原禁用。
二、各类常用封闭液优缺点与适用场景
BSA（脱脂无脂肪酸 BSA， 初筛）
✅ 优点：组分单一，杂质少，批次差异小于脱脂奶粉；适合定量 ELISA，背景可控；来源清晰，不易引入外源 IgG 干扰。
❌ 缺点：成本更高；部分抗原体系下封闭效果弱于奶粉；要选用无蛋白酶、无生物素、无 IgG 级别 BSA（生物素标记体系尤其重要）。
⚠️ 不建议使用普通粗制 BSA，杂质容易带来高背景。
脱脂奶粉
✅ 优点：价格低廉，混合多种蛋白，封闭疏水空位能力强，很多多抗体系可以显著降低背景。
❌ 缺点：成分复杂，含有多种动物 IgG、磷酸酶、生物素、蛋白酶，批次波动大；不适合磷酸化抗原检测、生物素 - 链霉亲和素体系、精准定量试剂盒开发；部分天然抗原会被奶粉中蛋白酶降解。
正常动物血清（如山羊血清、驴血清）
✅ 优点：封闭效果好，还可抑制 Fc 受体非特异结合，常用于多抗高背景体系。
❌ 缺点：含有完整 IgG，必须确认和二抗物种无交叉；成本高；批次差异大；容易引入内源生物素、酶。
✅ 使用原则：优先选用和二抗同一物种的正常血清。
明胶（动物源明胶）
✅ 优点：大分子惰性蛋白，适合部分对 BSA、奶粉敏感的体系。
❌ 缺点：低温易凝胶析出，操作温度敏感；部分批次杂质多；封闭能力偏弱，常和 BSA 搭配使用。
聚合物封闭液（商业化惰性封闭剂，如 PVA、PEG）
✅ 优点：不含动物 IgG、蛋白酶、生物素，批次稳定，适合开发试剂盒，几乎无交叉反应风险。
❌ 缺点：单独使用封闭能力有限，常搭配少量 BSA；成本偏高；部分体系会抑制特异性结合，需要充分验证。
❌ 禁忌封闭：蛋清、粗蛋白提取物、未纯化 IgG 溶液，杂质复杂，极容易出现不稳定背景。
三、非变性体系专属风险点
不要使用高温配制封闭液，高温会导致部分天然包被抗原变性；配制全程常温或冰上操作。
封闭时间、温度需要匹配：常用 37℃ 1 h 或 4℃过夜；4℃长时间封闭要防止液体蒸发干孔，干孔会造成不可逆非特异吸附。
封闭后洗涤不能省略，松散吸附的封闭蛋白必须洗去，否则会缓慢解离抬高背景；洗涤液配方需要和封闭液配套评估。
基质干扰联动验证：纯缓冲筛选好的封闭液，换到血清、细胞上清样本后，背景可能回升，必须做加标回收验证。
四、封闭液筛选评价指标（和整套工艺配套）
信噪比 S/N（首要）
阳性信号保留，不能出现封闭后信号显著下降（位阻 / 抗原变性）
空白孔、阴性对照 OD 水平
平行孔 CV、板间重复性
长期稳定性：4℃放置后批次差异
五、推荐初筛方案
初次搭建非变性间接 ELISA，优先选择 1% 无 IgG 无蛋白酶 BSA，以 pH7.4 PBS 为基底，不加 Tween-20 作为起始封闭液；若背景偏高，再评估正常血清，尽量晚选用脱脂奶粉。
六、常见误区
直接照搬常规变性 ELISA 使用脱脂奶粉，用于定量试剂盒或磷酸化 / 生物素体系，造成结果不稳定；
封闭蛋白物种和二抗物种冲突，引入 IgG 交叉反应；
封闭液添加高浓度 Tween，洗脱包被天然抗原；
封闭液优化时同步改动包被、一抗条件，破坏单一变量；
选用粗制 BSA，忽略内源蛋白酶、生物素污染。