人（Human）雌激素（E）ELISA检测试剂盒（竞争法）

【产品货号】DM-H290

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【注意事项】

实验前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行。

所有试剂需在有效期内使用，不同批次的试剂不得混用。

操作时需戴手套、口罩，避免试剂接触皮肤和黏膜。

TMB底物溶液有潜在致癌性，终止液为强酸，操作时需小心，若不慎接触，立即用大量清水冲洗。

实验结束后，废弃物应按照生物安全规定处理。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

不同实验目的会选用不同方案：想要验证天然折叠蛋白之间识别，多用非变性间接模式；检测样本中低含量目标物，双抗体夹心法更合适；检测小分子物质，竞争 ELISA 更为常用。同时要注意，这套实验结果只能反映固相环境下的结合情况，如果想要确认溶液中天然状态下蛋白能否互相作用，还需要搭配免疫共沉淀等其他实验交叉佐证。

ELISA 小科普
ELISA 全称酶联免疫吸附实验，是一套依靠蛋白之间特异性配对结合来做检测的常用实验手段，整体操作依靠缓冲液、固相板、标记工具与显色反应完成。
整套实验的核心逻辑可以简单理解为：利用两种蛋白专一配对的特性，把目标物质固定在板子上，再借助带酶标记的配套蛋白，催化显色底物产生颜色变化。颜色深浅和样本里目标物质的含量存在对应关系，借助仪器读取数值后，就能推算样本中待测物多少。
实验常用聚苯乙烯微孔板作为固相载体，这类板材可以吸附蛋白分子。按照反应布局，分为直接法、间接法、夹心法、竞争法几种主流模式。间接法常用来评估配对蛋白之间的识别能力，包被在板上的蛋白保持天然空间结构时，就是非变性间接体系，多用于验证蛋白能否在自然折叠状态下互相识别。
完整流程大致分为几个阶段：首先配制合适缓冲液，将已知蛋白包被到微孔板内；接着加入封闭材料，填满板子上空闲的吸附位点，减少后续多余蛋白的非特异附着；之后依次加入待测试配对蛋白、带酶标记的配套蛋白，每一轮孵育结束都要用洗涤液洗去没有结合上去的游离组分； 加入显色底物，等待充分显色后终止反应，酶标仪读取每孔吸光度数值。
整套实验有很多可以调整的条件，比如包被蛋白的投料浓度、测试蛋白的稀释比例、孵育的温度和时长、洗涤缓冲液配方、封闭材料种类。调整这些条件的目标，都是在保留特异性信号的同时压低背景干扰，提升结果稳定性，缩小孔与孔之间的数据偏差。
这个技术应用场景很广，基础科研里用来验证蛋白相互识别、测定样本内蛋白含量，工艺开发中用来优化试剂配方，还可以用于样品批量筛查。它优势在于可以一次性处理多个样本，操作流程标准化，数据方便定量对比；局限是整套体系容易受样本里杂蛋白、缓冲环境酸碱度、离子强度影响，条件不合适时容易出现背景偏高或者信号不足，需要系统优化整套参数。
不同实验目的会选用不同方案：想要验证天然折叠蛋白之间识别，多用非变性间接模式；检测样本中低含量目标物，双抗体夹心法更合适；检测小分子物质，竞争 ELISA 更为常用。同时要注意，这套实验结果只能反映固相环境下的结合情况，如果想要确认溶液中天然状态下蛋白能否互相作用，还需要搭配免疫共沉淀等其他实验交叉佐证。