人（Human）5脂加氧酶（5-LOX）ELISA检测试剂盒

【产品货号】DM-H289

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【注意事项】

实验前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行。

所有试剂需在有效期内使用，不同批次的试剂不得混用。

操作时需戴手套、口罩，避免试剂接触皮肤和黏膜。

TMB底物溶液有潜在致癌性，终止液为强酸，操作时需小心，若不慎接触，立即用大量清水冲洗。

实验结束后，废弃物应按照生物安全规定处理。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

【笃玛实验服务代测】

ELISA（酶联免疫吸附实验）代测是科研和临床检测中最常用的外包服务之一，基于抗原抗体特异性结合原理，可对生物样本中的微量物质进行定量或定性检测。

一、按检测靶标类型分类

1. 细胞因子与趋化因子类

这是科研中需求量 的代测类别，主要用于免疫、炎zheng、肿liu、心xue管等研究

白细胞介素家族：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23 等

干扰素家族：IFN-α、IFN-β、IFN-γ

肿liu坏死因子家族：TNF-α、TNF-β、LTA

趋化因子家族：CCL2 (MCP-1)、CCL5 (RANTES)、CXCL8 (IL-8)、CXCL10 (IP-10)

生长因子家族：EGF、VEGF、FGF、PDGF、TGF-β、NGF、IGF-1

2. yan症与免疫相关标志物

急性期反应蛋白：CRP、SAA、PCT、纤维蛋白原

补体系统：C3、C4、C5a、C1q

免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgE、IgD 及各亚型

免疫细胞表面标志物：sCD4、sCD8、sCD14、sCD163

3. 激素与内fen泌相关

垂体激素：FSH、LH、TSH、GH、PRL、ACTH

甲状腺激素：T3、T4、FT3、FT4、TSH

性激素：雌二醇 (E2)、孕酮 (P)、睾酮 (T)、雌酮、脱氢表雄酮

代谢激素：胰岛素、胰高xue糖素、瘦素 (Leptin)、脂联素 (Adiponectin)、抵抗素

应激激素：皮质醇、肾上腺su、去甲肾上腺su

4. 肿liu标志物

广谱肿liu标志物：CEA、AFP、CA125、CA19-9、CA15-3、CA72-4

器官特异性标志物：PSA 、NSE、CYFRA21-1、SCC

肿liu相关蛋白：MMP-2、MMP-9、TIMP-1、VEGF、EGFR

5. 自身抗体类

抗核抗体谱：ANA、抗 ds-DNA、抗 Sm、抗 SSA、抗 SSB

类风shi相关：RF、抗 CCP、抗角蛋白抗体

血guan炎相关：ANCA (c-ANCA、p-ANCA)、抗内皮细胞抗体

其他自身抗体：抗甲状腺抗体 (TPOAb、TgAb)、抗胰岛素抗体、抗磷脂抗体

6. 心血guan疾bing相关标志物

心ji损伤标志物：cTnI、cTnT、CK-MB、Myoglobin

心功能标志物：BNP、NT-proBNP

动脉zhou样硬化标志物：ox-LDL、Lp-PLA2、hs-CRP、同型半胱氨酸

凝血与纤溶：D - 二聚体、FDP、PAI-1、t-PA

7. 神经科学相关

神经递质：5 - 羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺su、乙酰胆碱、γ- 氨基丁酸

神经退行性标志物：Aβ1-40、Aβ1-42、Tau 蛋白、磷酸化 Tau 蛋白

神jing炎zheng标志物：GFAP、S100B、NSE、MBP

8. 其他常见靶标

代谢物：葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、尿酸、肌酐

病原体抗原 / 抗体：乙gan五项、bing肝抗体、梅du抗体、HIV 抗体、 抗原 / 抗体

药物浓度：抗生素、化liao药物、免yi抑制剂血药浓度

多克隆抗体非特异性吸附的解决思路
多抗因为包含多种不同亲和力、不同特异性的 IgG 亚型，极易和抗原以外的蛋白、固相载体、封闭组分发生非特异性结合，整体优化分为封闭优化、抗体工作液优化、洗涤条件优化、样本前处理、抗体纯化改造、体系替换六大方向。
一、封闭体系优化（最常用）
核心是用惰性蛋白占据固相载体多余疏水结合位点，阻断抗体直接吸附板 / 膜。
更换封闭剂：常规 5% 脱脂奶存在磷酸化蛋白、生物素、内源酶干扰，高背景时换成 1–3% BSA（无蛋白酶、无 IgG 级别）；膜封闭可选用酪蛋白封闭液；复杂样本可使用商业化专用封闭液（含封闭增强剂）。
调整封闭时间与温度：4℃过夜封闭优于室温 1–2h，充分饱和疏水位点；避免封闭液干燥，干膜 / 干板会大幅升高非特异吸附。
封闭液添加剂：适量 Tween-20（0.05–0.1%）降低疏水相互作用；可添加少量甘氨酸（0.1M）中和电荷吸附；注意 Tween 浓度过高会破坏特异性结合。
二、一抗（多克隆抗体）工作液优化
抗体梯度稀释：多抗常因浓度过高造成非特异，做倍比稀释找到信噪比 工作浓度，不要直接使用说明书推荐上限。
稀释液改造：使用含 BSA/Tween 的专用抗体稀释液，不要用纯水或单纯 PBS 稀释；可加入 0.1–0.5M NaCl 提高离子强度，削弱静电非特异结合。
预吸附处理（多抗特有关键方法）：使用正常血清、组织裂解液、固相载体填料对多抗进行预吸收，去除识别杂蛋白的交叉反应 IgG；也可用脱脂棉 / 琼脂糖填料吸附疏水杂抗体。
抗体纯化升级：粗制抗血清换成亲和纯化 IgG（Protein A/G）；要求更高时用抗原亲和层析，只保留识别目标抗原的特异性抗体组分，去除大量杂 IgG。
三、洗涤条件优化（减少可逆非特异结合）
洗涤液：TBST 通常优于 PBST，磷酸盐容易造成部分蛋白电荷聚集；Tween 维持 0.05–0.1%。
洗涤流程：增加洗涤次数（3–5 次），每次充分浸泡，浸泡 3–5 min；洗板时保证液体完全覆盖，避免气泡残留。
调整 pH 与盐浓度：微调洗涤液 pH 偏离抗体等电点，增加 NaCl 浓度，降低静电吸附；注意不可过强，防止特异性信号丢失。
四、样本前处理优化
样本稀释：高浓度样本存在蛋白聚集、钩状效应，梯度稀释样本，降低杂蛋白总量。
去除干扰物：血清样本可离心去除脂质沉淀；组织裂解液澄清离心，去除不溶性碎片；必要时使用 IgG 吸附填料去除样本内源 IgG 干扰。
蛋白酶抑制剂：防止抗原降解产生杂片段，增加交叉识别。
五、孵育条件控制
孵育温度：优先 4℃缓慢结合，减少高温下疏水非特异吸附；室温孵育容易背景升高。
孵育时间：缩短一抗孵育时长，减少非特异性 IgG 随机吸附机会，配合稀释优化平衡信号。
避光、防止蒸发：体系浓缩会造成局部抗体浓度骤升，背景暴涨。
六、进阶方案：体系改造与替代
二抗优化：选用经血清吸附的预吸收二抗，避免二抗识别样本内源 IgG；降低二抗工作浓度。
竞争封闭：加入过量无关 IgG，占据载体非特异结合位点。
载体改性：换成低吸附酶标板、NC 膜换成 PVDF 或低背景修饰膜；减少载体本身疏水吸附。
技术替代：如果多抗始终无法降低背景，在条件允许下更换单克隆抗体；或使用抗原特异性片段 Fab 替代完整 IgG，去除 Fc 段介导的非特异结合。
补充区分两种非特异来源，方便定位
Fc 段介导：载体、二抗、Fc 受体结合 → 用 Protein A/G 纯化、Fab 片段、高盐洗涤解决
Fab 交叉反应（多抗特有）：抗体识别样本内同源杂蛋白 → 抗原亲和纯化、预吸收、降低抗体浓度