人（Human）5脂加氧酶（5-LOX）ELISA检测试剂盒

【产品货号】DM-H289

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【注意事项】

实验前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行。

所有试剂需在有效期内使用，不同批次的试剂不得混用。

操作时需戴手套、口罩，避免试剂接触皮肤和黏膜。

TMB底物溶液有潜在致癌性，终止液为强酸，操作时需小心，若不慎接触，立即用大量清水冲洗。

实验结束后，废弃物应按照生物安全规定处理。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

ELISA 样本梯度稀释全程误差规避细则
一、稀释前准备：消除系统基础误差
稀释液严格统一
只使用试剂盒配套样本稀释液，禁止用 PBS、超纯水、洗涤液替代，保证基质、pH、离子强度、保护蛋白与标准品体系完全一致，避免基质效应导致回收率失真。稀释液提前室温平衡，低温液体移液体积会产生偏差。
移液器与枪头规范
选用对应量程移液器，微量体系优先用小量程枪；移液前对试剂预润洗枪头 3 次，减少内壁挂液损耗；全程使用带滤芯无菌枪头，防止气溶胶交叉污染。移液器定期计量校准，杜绝本身系统偏差。
提前排版定梯度，减少临场慌乱
在 1.5 mL EP 管架按顺序摆放，用笔标注原液、2×、4×、8×、16×…… 稀释倍数；先向所有空管统一加入固定体积稀释液（如每管 100 μL），避免逐个加液耗时不一致。
样本预处理到位
待测样本短暂涡旋混匀，瞬时低速离心甩下管壁冷凝水；组织裂解液、浑浊上清先离心取清亮上清，避免固体颗粒吸入枪头造成移液体积不准。
二、稀释过程核心操作：杜绝人为移液误差
固定稀释方向：只能由高浓度向低浓度逐级稀释
从原液→2 倍→4 倍→8 倍依次传递， 不可反向操作。每吸取上一级稀释液加入下一级管子后立刻更换全新枪头， 消除高浓度残留带入低浓度管的携带污染（carryover），这是梯度点离散最主要原因。
吹打混匀标准化动作
液体打入下一级稀释液后，连续缓慢吹打 10 次以上，枪头紧贴管壁涮洗附着液体全部混入体系；涡旋震荡轻柔几秒，不可剧烈高速涡旋造成蛋白变性。每一级混匀后再吸取液体往下传递。
体积管控规则
设定等体积倍比稀释（如 100 μL 样本 + 100 μL 稀释液），保证稀释倍数精准； 一管混匀后可弃去多余液体，使所有 EP 管终体积一致，防止蒸发带来浓度差异。吸液时移液器活塞按 停点平稳吸取，排液按 停点排净，排液后枪头在液面停留 1s 再提起，减少挂壁残留。
全程冰上操作，缩短放置时间
稀释整套过程置于冰盒上完成，减少室温下目标抗原被蛋白酶降解；全部稀释完成尽快上酶标板，不要长时间静置等待。
三、稀释后上板环节规避二次误差
稀释液再次离心混匀
所有梯度管稀释完毕，统一瞬时离心，将管壁挂着的液体甩至管底，保证管内浓度均一，避免吸取上层或下层浓度不均。
上板加样规则统一
每一个稀释梯度设置 2～3 个相邻复孔；加样姿势垂直悬空打入微孔侧壁，不刮擦包被孔底；不同稀释梯度之间更换枪头，管与管之间不混用枪头。整块梯度样本集中快速加完，缩小孵育起始时间差。
同步配套完整质控体系
梯度稀释验证必须同板设置合格标准曲线、空白孔、阴性对照、阳性质控，若本板标曲 R² 不足、对照异常，稀释验证数据直接作废。
四、不同梯度类型专属避坑要点
2 倍连续倍比稀释（Hook 效应验证常用）
逐级传递最容易发生交叉污染，务必一级一枪；不要连续稀释超过 5 个梯度，末端浓度过低信噪比不足，失去判定意义。
10 倍大跨度梯度稀释（粗略筛查浓度）
单次加入稀释液体积大，吹打次数加倍，确保高浓度样本被充分打散；注意记录准确稀释倍数，后续回算原始浓度不要算错倍率。
五、数据计算层面收尾误差规避
严格公式：原始浓度 = 仪器测定浓度 × 稀释倍数，多级连续稀释为倍数相乘（2× 再稀释 2× 总倍数为 4 倍）。
剔除复孔 CV＞10% 的异常孔再计算均值；连续 3 个梯度回算原始浓度波动在 80%~120% 才算稀释验证有效。
不使用超出标准曲线 点、低于 检出限的稀释点参与回收率计算。
六、浓缩一句话实操要点
预加稀释液定体积，浓到稀逐级往下递；
每级换枪充分吹，离心甩壁浓度齐；
冰上操作尽快上，倍率算清看回收率。