人（Human）胰岛素样生长因子结合蛋白-2（IGFBP-2）ELISA检测试剂盒

【产品货号】DM-H292

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【注意事项】

实验前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行。

所有试剂需在有效期内使用，不同批次的试剂不得混用。

操作时需戴手套、口罩，避免试剂接触皮肤和黏膜。

TMB底物溶液有潜在致癌性，终止液为强酸，操作时需小心，若不慎接触，立即用大量清水冲洗。

实验结束后，废弃物应按照生物安全规定处理。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

【笃玛实验服务代测】

ELISA（酶联免疫吸附实验）代测是科研和临床检测中最常用的外包服务之一，基于抗原抗体特异性结合原理，可对生物样本中的微量物质进行定量或定性检测。

一、按检测靶标类型分类

1. 细胞因子与趋化因子类

这是科研中需求量 的代测类别，主要用于免疫、炎zheng、肿liu、心xue管等研究

白细胞介素家族：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23 等

干扰素家族：IFN-α、IFN-β、IFN-γ

肿liu坏死因子家族：TNF-α、TNF-β、LTA

趋化因子家族：CCL2 (MCP-1)、CCL5 (RANTES)、CXCL8 (IL-8)、CXCL10 (IP-10)

生长因子家族：EGF、VEGF、FGF、PDGF、TGF-β、NGF、IGF-1

2. yan症与免疫相关标志物

急性期反应蛋白：CRP、SAA、PCT、纤维蛋白原

补体系统：C3、C4、C5a、C1q

免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgE、IgD 及各亚型

免疫细胞表面标志物：sCD4、sCD8、sCD14、sCD163

3. 激素与内fen泌相关

垂体激素：FSH、LH、TSH、GH、PRL、ACTH

甲状腺激素：T3、T4、FT3、FT4、TSH

性激素：雌二醇 (E2)、孕酮 (P)、睾酮 (T)、雌酮、脱氢表雄酮

代谢激素：胰岛素、胰高xue糖素、瘦素 (Leptin)、脂联素 (Adiponectin)、抵抗素

应激激素：皮质醇、肾上腺su、去甲肾上腺su

4. 肿liu标志物

广谱肿liu标志物：CEA、AFP、CA125、CA19-9、CA15-3、CA72-4

器官特异性标志物：PSA 、NSE、CYFRA21-1、SCC

肿liu相关蛋白：MMP-2、MMP-9、TIMP-1、VEGF、EGFR

5. 自身抗体类

抗核抗体谱：ANA、抗 ds-DNA、抗 Sm、抗 SSA、抗 SSB

类风shi相关：RF、抗 CCP、抗角蛋白抗体

血guan炎相关：ANCA (c-ANCA、p-ANCA)、抗内皮细胞抗体

其他自身抗体：抗甲状腺抗体 (TPOAb、TgAb)、抗胰岛素抗体、抗磷脂抗体

6. 心血guan疾bing相关标志物

心ji损伤标志物：cTnI、cTnT、CK-MB、Myoglobin

心功能标志物：BNP、NT-proBNP

动脉zhou样硬化标志物：ox-LDL、Lp-PLA2、hs-CRP、同型半胱氨酸

凝血与纤溶：D - 二聚体、FDP、PAI-1、t-PA

7. 神经科学相关

神经递质：5 - 羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺su、乙酰胆碱、γ- 氨基丁酸

神经退行性标志物：Aβ1-40、Aβ1-42、Tau 蛋白、磷酸化 Tau 蛋白

神jing炎zheng标志物：GFAP、S100B、NSE、MBP

8. 其他常见靶标

代谢物：葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、尿酸、肌酐

病原体抗原 / 抗体：乙gan五项、bing肝抗体、梅du抗体、HIV 抗体、 抗原 / 抗体

药物浓度：抗生素、化liao药物、免yi抑制剂血药浓度

抗体用于 CoIP 适用性验证方法
CoIP 对抗体有特殊要求：抗体必须能够识别天然构象完整的抗原、可在温和非变性裂解条件下结合靶蛋白、抗体与抗原复合物可被沉淀，同时尽量减少非特异 IgG、杂蛋白共沉淀。很多 WB 好用的多抗 / 单抗并不适合 CoIP（仅识别变性表位）。验证分为体外预实验、对照 CoIP、结构与文献核查三层，由简到繁。
一、前期基础核查（低成本初筛，优先做）
文献与说明书核查
查阅抗体产品说明书是否标注CoIP validated / IP validated；检索已发表文献，确认同抗体、同物种、同细胞 / 组织样本下有人成功做 CoIP。无文献验证不等于不能用，但风险更高。
抗原表位类型判断
若抗体免疫原是多肽（通常 10–20 aa 短肽），大多识别线性表位，蛋白变性后才暴露，天然构象蛋白上结合弱，CoIP 失败率很高；免疫原为全长重组蛋白、完整蛋白复合物的抗体，更适合 IP/CoIP。
抗体亚型与形式核查
完整 IgG 适合 Protein A/G beads；部分小鼠 IgG 亚型（如 IgG1、IgG2b）结合能力差异大；Fab、scFv 一般不适合常规 CoIP。多克隆抗体要留意杂 IgG 带来高背景。
二、简易体外结合验证（不做完整 CoIP，快速初筛）
非变性 ELISA / 构象 ELISA
使用天然折叠的重组靶蛋白包被（不进行变性），检测抗体是否结合。天然蛋白有信号说明可识别构象表位；若仅变性蛋白有信号，基本不适合 CoIP。
微量免疫沉淀（mini-IP，单蛋白 IP，核心初筛）
这是最关键前置验证：先做靶蛋白单独 IP，而不是直接 CoIP。
使用温和非变性裂解液（如 NP-40，避免 SDS、脱氧胆酸钠等强变性去污剂）制备细胞 / 组织裂解上清
分为两组：特异性抗体组 + 同物种同亚型对照 IgG 组
孵育后用 Protein A/G 磁珠捕获复合物，洗涤，洗脱，WB 检测沉淀复合物中是否存在靶抗原
判断标准：特异性抗体组能清晰富集靶蛋白，对照 IgG 几乎无靶蛋白富集，说明该抗体可用于 IP，具备 CoIP 基础；如果靶蛋白都拉不下来，直接放弃 CoIP。
免疫荧光 IF 辅助参考
IF 使用非变性固定透化条件，抗体可识别细胞内天然抗原，可作为辅助证据；但 IF 阳性≠一定适合 CoIP，仅作参考。
三、完整 CoIP 体系验证（包含互作蛋白，模拟正式实验）
在 mini-IP 验证成功后，进行正式 CoIP 对照实验，设置全套对照区分真假互作、抗体非特异：
对照组
阴性对照 IgG（同物种、同亚型、同浓度）：排除 beads、IgG 本身非特异吸附杂蛋白
空载 / 敲除对照组：靶抗原 KO 细胞、不表达靶蛋白的样本，排除杂蛋白交叉识别
反向 CoIP（Reciprocal CoIP）：使用互作伴侣蛋白的抗体反向拉靶蛋白，互相印证，排除抗体自身带来的假阳性
输入对照 Input：裂解上清，证明样本内两种蛋白本身均存在
结果判定标准
特异性抗体组：可同时检测到靶抗原 + 候选互作蛋白
对照 IgG 组：两种蛋白均无明显条带
KO / 阴性样本组：无靶抗原，无互作蛋白条带
同时满足，说明抗体适用于 CoIP。
四、进阶验证（用于投稿、区分假阳性）
洗脱方式对比验证
分别使用低 pH 洗脱（甘氨酸 pH2.7）、SDS 上样缓冲液煮沸洗脱，观察条带；评估抗体 - 抗原复合物稳定性，判断是否容易解离。
交联 CoIP 对照（可选）
使用可逆交联剂（DSP、甲醛）预交联蛋白复合物，对比有无交联的富集效果；适合弱相互作用，同时验证抗体在交联条件下仍可结合抗原。
质谱鉴定（MS 验证）
IP 复合物送质谱，看靶抗原是否为高丰度富集蛋白，有无大量杂蛋白；评估抗体特异性，适合需要高质量 CoIP-MS 的课题。
五、常见判定失败的情况
mini-IP 完全拉不到靶蛋白：抗体识别变性表位，不适合 CoIP
IP 能拉下靶蛋白，但 CoIP 无法富集互作蛋白：蛋白相互作用弱、裂解条件破坏复合物，不一定是抗体问题，可调整裂解液
IgG 对照和特异性抗体都有大量条带：抗体 / 多抗非特异吸附严重，需要预吸附处理或更换抗体
补充实操建议
优先使用抗原亲和纯化的多抗，粗制抗血清背景高，CoIP 很难优化；
验证时建议设置多个抗体浓度梯度，避免抗体过量带来非特异；
若 mini-IP 失败，不要直接进入 CoIP 互作验证，优先更换抗体。