人（Human）AXL受体酪氨酸激酶（AXL）ELISA检测试剂盒

【产品货号】DM-H298

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【注意事项】

实验前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行。

所有试剂需在有效期内使用，不同批次的试剂不得混用。

操作时需戴手套、口罩，避免试剂接触皮肤和黏膜。

TMB底物溶液有潜在致癌性，终止液为强酸，操作时需小心，若不慎接触，立即用大量清水冲洗。

实验结束后，废弃物应按照生物安全规定处理。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

一、ELISA到底是在做什么？
可以把ELISA板子理解成一排排“微型检测工位”。
每一个小孔，都可以独立完成一次检测。我们先在小孔里固定好已知的“锁”，再加入待测样品里的“钥匙”，如果两者匹配，就会稳稳结合；不匹配就不会停留。
之后再加入带“显色功能”的配套试剂，结合成功的位置就会慢慢变蓝/变黄，颜色越深，说明样品里的目标物质越多。
用仪器读取颜色深浅，就能转换成精准数字，实现肉眼定性、仪器定量。
二、为什么ELISA能测的这么准？
生活里很多东西混在一起分不清，但生物配对蛋白有两个超级优势：
1. 专一性极强：只认准自己的搭档，不会随便黏上其他杂蛋白；
2. 灵敏度极高：哪怕浓度极低、肉眼完全看不见，也能通过显色放大信号测出来。
实验里所有的优化操作，本质都是一句话：让该结合的好好结合，不该结合的全部洗掉、挡住。
三、ELISA完整流程通俗拆解
1. 包被：把“锁”固定在板子上
利用微孔板自带的吸附特性，把我们需要的目标蛋白均匀固定在孔底。这一步相当于给每个工位提前放好检测工具。固定的浓度、温度、时间，会直接影响后续检测是否稳定。
2. 封闭：堵住空位，防止乱黏附
板子没被蛋白盖住的空白位置，很容易乱粘试剂和样品杂质，造成背景脏、数据不准。所以要用惰性蛋白把所有空余位置全部填满，相当于给工位做“防粘处理”。
3. 加样孵育：让钥匙找锁
加入待测样品和配套识别蛋白，在合适温度下静置反应。温度太低、时间太短，配对不充分；温度太高、时间太久，又会出现多余的非特异黏附。
4. 洗涤：洗掉所有多余杂质
所有没配对成功、松散附着、多余漂浮的物质，全部通过洗涤液洗掉。洗得干净，背景就低、数据就准；洗不干净就会整片显色、数据失真。
5. 显色读数：把结合量变成颜色与数字
加入显色液后，配对成功的位置会发生颜色变化，反应终止后用仪器读取数值，颜色越深、数值越高，代表样品里目标物质含量越高。
四、ELISA常见四种模式（通俗区分）
1. 间接法：主要用来验证两个蛋白能不能正常识别配对，适合验证试剂适用性、优化实验条件，不适合测未知样品。
2. 夹心法：精准测样品含量，灵敏度 ，日常定量检测最常用。
3. 竞争法：适合小分子物质检测，靠“抢位置”的原理判断含量。
4. 直接法：步骤 、速度 ，适合快速初筛。
五、什么是非变性ELISA？（超好懂解释）
很多实验会把蛋白“拆开、变性”，破坏原本的立体结构。
而非变性ELISA，就是全程温柔操作，不破坏蛋白天然立体形态，完全模拟蛋白在生物体内原本的样子。
这种实验的意义很大：有些蛋白只认立体结构、不认拆开的线性结构。普通变性实验能出结果，不代表蛋白在体内能正常工作；但非变性实验合格，说明蛋白在自然状态下可以正常识别、正常配对。
六、为什么ELISA需要反复优化条件？
ELISA不是固定公式，每一组蛋白、每一种样品，适配的条件都不一样。
微调不同条件，对应解决不同问题：
- 包被浓度：决定板子上检测工具够不够多、会不会堆叠浪费
- 试剂稀释比例：决定识别精准度、背景高低
- 孵育温时：决定配对是否充分、是否产生多余杂结合
- 洗涤液配方：决定杂质清理是否干净、是否损伤目标蛋白
- 封闭体系：决定整块板子的干净程度、数据稳定性
所有优化最终只为一件事：提高有效信号、压低无效背景，让数据稳定、真实、可重复。
七、ELISA的优势与特点
1. 操作简单、流程标准化，适合大批量样品检测
2. 灵敏度高，能检测极低浓度的微量物质
3. 结果可量化，不是凭肉眼判断，而是精准数字
4. 成本适中、设备通用，是科研、筛查、实验开发的基础技术
八、ELISA结果好坏怎么判断？（通俗版）
1. 阳性有明显颜色、阴性几乎无色（特异性好）
2. 同一组孔数值接近、差距小（重复性好）
3. 颜色深浅梯度均匀、不乱跳（线性正常）
4. 整体背景干净、无整片泛蓝泛黄（体系干净）
九、生活类比总结（一秒看懂ELISA）
ELISA就像精准安检匹配系统：
板子是安检台，固定蛋白是专属安检卡扣，样品是通行人员，配对蛋白是专属通行证，显色是匹配成功的指示灯。
匹配成功→亮灯显色；匹配失败、杂乱杂质→全部被冲洗带走。
灯越亮，说明合格通行的目标物质越多。