人（Human）G补缀FHA域血guan生成因子1（AGGF1）ELISA检测试剂盒

【产品货号】DM-H310

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【储存条件及有效期】

试剂盒未开封时，于2-8℃避光保存，有效期为6个月。酶标板需密封保存于2-8℃，避免受潮。

【需要准备的器材和试剂】

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【注意事项】

实验前请仔细阅读说明书，严格按照操作步骤进行。

所有试剂需在有效期内使用，不同批次的试剂不得混用。

操作时需戴手套、口罩，避免试剂接触皮肤和黏膜。

TMB底物溶液有潜在致癌性，终止液为强酸，操作时需小心，若不慎接触，立即用大量清水冲洗。

实验结束后，废弃物应按照生物安全规定处理。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

【笃玛实验服务代测】

ELISA（酶联免疫吸附实验）代测是科研和临床检测中最常用的外包服务之一，基于抗原抗体特异性结合原理，可对生物样本中的微量物质进行定量或定性检测。

一、按检测靶标类型分类

1. 细胞因子与趋化因子类

这是科研中需求量 的代测类别，主要用于免疫、炎zheng、肿liu、心xue管等研究

白细胞介素家族：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23 等

干扰素家族：IFN-α、IFN-β、IFN-γ

肿liu坏死因子家族：TNF-α、TNF-β、LTA

趋化因子家族：CCL2 (MCP-1)、CCL5 (RANTES)、CXCL8 (IL-8)、CXCL10 (IP-10)

生长因子家族：EGF、VEGF、FGF、PDGF、TGF-β、NGF、IGF-1

2. yan症与免疫相关标志物

急性期反应蛋白：CRP、SAA、PCT、纤维蛋白原

补体系统：C3、C4、C5a、C1q

免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgE、IgD 及各亚型

免疫细胞表面标志物：sCD4、sCD8、sCD14、sCD163

3. 激素与内fen泌相关

垂体激素：FSH、LH、TSH、GH、PRL、ACTH

甲状腺激素：T3、T4、FT3、FT4、TSH

性激素：雌二醇 (E2)、孕酮 (P)、睾酮 (T)、雌酮、脱氢表雄酮

代谢激素：胰岛素、胰高xue糖素、瘦素 (Leptin)、脂联素 (Adiponectin)、抵抗素

应激激素：皮质醇、肾上腺su、去甲肾上腺su

4. 肿liu标志物

广谱肿liu标志物：CEA、AFP、CA125、CA19-9、CA15-3、CA72-4

器官特异性标志物：PSA 、NSE、CYFRA21-1、SCC

肿liu相关蛋白：MMP-2、MMP-9、TIMP-1、VEGF、EGFR

5. 自身抗体类

抗核抗体谱：ANA、抗 ds-DNA、抗 Sm、抗 SSA、抗 SSB

类风shi相关：RF、抗 CCP、抗角蛋白抗体

血guan炎相关：ANCA (c-ANCA、p-ANCA)、抗内皮细胞抗体

其他自身抗体：抗甲状腺抗体 (TPOAb、TgAb)、抗胰岛素抗体、抗磷脂抗体

6. 心血guan疾bing相关标志物

心ji损伤标志物：cTnI、cTnT、CK-MB、Myoglobin

心功能标志物：BNP、NT-proBNP

动脉zhou样硬化标志物：ox-LDL、Lp-PLA2、hs-CRP、同型半胱氨酸

凝血与纤溶：D - 二聚体、FDP、PAI-1、t-PA

7. 神经科学相关

神经递质：5 - 羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺su、乙酰胆碱、γ- 氨基丁酸

神经退行性标志物：Aβ1-40、Aβ1-42、Tau 蛋白、磷酸化 Tau 蛋白

神jing炎zheng标志物：GFAP、S100B、NSE、MBP

8. 其他常见靶标

代谢物：葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、尿酸、肌酐

病原体抗原 / 抗体：乙gan五项、bing肝抗体、梅du抗体、HIV 抗体、 抗原 / 抗体

药物浓度：抗生素、化liao药物、免yi抑制剂血药浓度

血清灭活效果的细胞生物学验证操作步骤
实验原理
选用对补体敏感的细胞（人 PBMC、原代 T 细胞、原代内皮细胞等，不能用普通肿liu细胞，这类细胞耐受补体，看不出差异），设置分组平行培养，通过细胞活率、LDH 释放、细胞碎片等指标判断待测血清是否存在残留补体活性。
判定逻辑：待测血清组结果和标准灭活血清组接近，而未灭活阳性对照组明显细胞损伤，说明灭活合格；待测组和未灭活组同样出现细胞损伤，代表灭活不 。
材料准备
细胞：人外周血单个核细胞 PBMC / 原代 T 细胞（优先推荐）
血清样本
待测血清：本次处理、待验证是否灭活完全的血清
标准灭活对照血清：同批次血清，严格执行 56℃、实温 30 min 灭活
阳性对照血清：同批次未灭活原始血清
完全培养基基础（不含血清）、台盼蓝、LDH 检测试剂盒、细胞培养板（24 孔板为宜）
细胞计数仪、离心机、CO₂培养箱
详细操作步骤
细胞制备与铺板
收集目标敏感细胞，用无血清基础培养基重悬，计数调整细胞浓度；24 孔板每孔加入相同数量细胞，推荐 PBMC 铺板密度 1×10⁶ cells/mL，每孔 1 mL 体系，每组设置 3 个技术复孔。
分组加样
分组如下，各组培养基中血清终浓度保持一致（常规 10%）：
标准灭活组：基础培养基 + 10% 标准灭活血清
待测血清组：基础培养基 + 10% 待测灭活血清
阳性对照组：基础培养基 + 10% 未灭活原始血清
空白培养基孔（LDH 检测用，无细胞）
轻柔混匀，放入 37℃、5% CO₂培养箱孵育，孵育时间建议16~24 h（补体介导的细胞损伤在这个时间段最容易显现，过长会叠加细胞自然凋亡干扰结果）。
样本收集与指标检测
① 细胞形态与碎片观察：倒置显微镜下直接观察各组细胞皱缩、碎片、聚团、漂浮死细胞情况并记录。
② 台盼蓝染色活率检测：收集孔内全部细胞悬液，离心重悬后台盼蓝染色，统计活细胞百分比。
③ LDH 释放检测：吸取各组上清，按照 LDH 试剂盒说明书检测上清 LDH 活性，LDH 升高代表细胞膜破损、细胞坏死。
结果判定
合格：待测组活率、LDH 水平、细胞形态 ≈ 标准灭活组；阳性对照组活率显著下降、LDH 明显升高、大量细胞碎片
灭活不 ：待测组和阳性对照组类似，活率降低、LDH 上升、细胞裂解增多
无效实验：阳性对照组没有明显细胞损伤（大概率细胞选择不合适，需更换更敏感的细胞）
关键注意事项
全程无菌操作，避免支原体、细菌污染干扰细胞状态；
血清样本解冻、混匀操作统一，避免不同组血清预处理不一致带来误差；
孵育时间不要超过 24 h，敏感细胞长时间体外培养会自发凋亡，干扰补体导致的损伤判断；
若没有 PBMC，可选用原代内皮细胞、原代成纤维细胞，HEK293、HeLa 等永生化肿liu细胞不适合本验证。
可选简化方案（快速初筛，不做 LDH）
只做显微镜观察 + 台盼蓝活率检测，省去 LDH 定量，适合日常快速筛查；如果需要严谨质控、用于课题数据支撑，建议保留 LDH 定量指标。