人（Human）肌酸（Creatine）ELISA检测试剂盒

【产品货号】DM-H307

【包装规格】48/96T

【用途】

本试剂盒用于体外定量检测[样本类型，如：人血清、血浆、组织匀浆等]中的含量。仅供科研使用，不用于临床诊断。

【检测原理】

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被检测指标抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1 将抗体包被在酶标板底部，加入待测抗原

2 加入酶标二抗放大信号

3 捕获抗体和检测抗体分别结合抗原的不同表位，形成“抗体-抗原-抗体”的三明治结构

4 加入底物

5 酶催化底物显色，吸光度与抗原浓度成正比，适用于大分子抗原的定量检测，如细胞因子、蛋白质等

【操作步骤】

1. 试剂准备

浓缩洗涤液：用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（如5mL浓缩洗涤液+95mL水），充分混匀。稀释后的洗涤液在2-8℃可保存1周。

标准品：根据说明书要求，用样品稀释液将标准品进行梯度稀释（具体稀释方法见说明书附录）。

酶标记抗体：使用前需室温平衡30分钟，若有沉淀，可轻轻混匀。

2. 样本处理

按照常规方法采集和处理[样本类型]，具体处理步骤如下：

血清：全血样本室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清液。

血浆：使用抗凝管采集血液，3000rpm离心10分钟，取上清液。

组织匀浆：取适量组织，按1:9比例加入PBS（pH7.4），冰浴匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液。

样本需在-20℃保存，避免反复冻融，检测前需室温解冻并充分混匀，如有沉淀需再次离心。

3.加样

将酶标板从铝箔袋中取出，平衡至室温。

设标准品孔、样本孔和空白孔。空白孔加50μL样品稀释液，标准品孔分别加50μL不同浓度的标准品，样本孔加50μL待测样本。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

4. 洗涤

弃去孔内液体，拍干。每孔加入200μL稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。

5. 加酶标记抗体

除空白孔外，每孔加入50μL酶标记抗体。

轻轻震荡混匀，37℃孵育30分钟。

6. 洗涤

同步骤4，洗涤5次。

7. 显色

每孔加入50μL底物溶液（TMB），轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15分钟。

8. 终止

每孔加入50μL终止液，轻轻震荡混匀，此时蓝色立即变为黄色。

9. 测定

在终止反应后10分钟内，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。

【结果计算】

以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，或使用酶标仪自带软件进行曲线拟合。根据样品的OD值，从标准曲线上查出相应的[检测项目名称]浓度。

标准曲线绘制示例：

标准品浓度（ng/mL）：0, 2, 4, 8, 16, 32
对应的OD值：[示例值，如：0.100, 0.250, 0.480, 0.850, 1.400, 2.100]
建议采用四参数 logistic 曲线（4-PL）拟合，相关系数R²应≥0.99。

【检测方法的局限性】

本试剂盒仅供科研使用，结果不能作为临床诊断的 依据。

样本处理不当可能导致结果偏差，应严格按照说明书操作。

高浓度样本可能存在hook效应，建议对OD值异常高的样本进行适当稀释后重新检测。

【标准品稀释方法】

1. 高浓度标准品（如32 ng/mL）为母液，无需稀释。
2. 取50μL 32 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到16 ng/mL标准品。
3. 取50μL 16 ng/mL标准品加入50μL样品稀释液中，混匀，得到8 ng/mL标准品。
4. 依次类推，稀释得到4 ng/mL、2 ng/mL标准品。
5. 0 ng/mL标准品即为样品稀释液。

【笃玛实验服务代测】

ELISA（酶联免疫吸附实验）代测是科研和临床检测中最常用的外包服务之一，基于抗原抗体特异性结合原理，可对生物样本中的微量物质进行定量或定性检测。

一、按检测靶标类型分类

1. 细胞因子与趋化因子类

这是科研中需求量 的代测类别，主要用于免疫、炎zheng、肿liu、心xue管等研究

白细胞介素家族：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23 等

干扰素家族：IFN-α、IFN-β、IFN-γ

肿liu坏死因子家族：TNF-α、TNF-β、LTA

趋化因子家族：CCL2 (MCP-1)、CCL5 (RANTES)、CXCL8 (IL-8)、CXCL10 (IP-10)

生长因子家族：EGF、VEGF、FGF、PDGF、TGF-β、NGF、IGF-1

2. yan症与免疫相关标志物

急性期反应蛋白：CRP、SAA、PCT、纤维蛋白原

补体系统：C3、C4、C5a、C1q

免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgE、IgD 及各亚型

免疫细胞表面标志物：sCD4、sCD8、sCD14、sCD163

3. 激素与内fen泌相关

垂体激素：FSH、LH、TSH、GH、PRL、ACTH

甲状腺激素：T3、T4、FT3、FT4、TSH

性激素：雌二醇 (E2)、孕酮 (P)、睾酮 (T)、雌酮、脱氢表雄酮

代谢激素：胰岛素、胰高xue糖素、瘦素 (Leptin)、脂联素 (Adiponectin)、抵抗素

应激激素：皮质醇、肾上腺su、去甲肾上腺su

4. 肿liu标志物

广谱肿liu标志物：CEA、AFP、CA125、CA19-9、CA15-3、CA72-4

器官特异性标志物：PSA 、NSE、CYFRA21-1、SCC

肿liu相关蛋白：MMP-2、MMP-9、TIMP-1、VEGF、EGFR

5. 自身抗体类

抗核抗体谱：ANA、抗 ds-DNA、抗 Sm、抗 SSA、抗 SSB

类风shi相关：RF、抗 CCP、抗角蛋白抗体

血guan炎相关：ANCA (c-ANCA、p-ANCA)、抗内皮细胞抗体

其他自身抗体：抗甲状腺抗体 (TPOAb、TgAb)、抗胰岛素抗体、抗磷脂抗体

6. 心血guan疾bing相关标志物

心ji损伤标志物：cTnI、cTnT、CK-MB、Myoglobin

心功能标志物：BNP、NT-proBNP

动脉zhou样硬化标志物：ox-LDL、Lp-PLA2、hs-CRP、同型半胱氨酸

凝血与纤溶：D - 二聚体、FDP、PAI-1、t-PA

一、细胞选择相关（最容易踩坑）

1. 严禁使用普通永生化肿liu细胞（HeLa、293、CHO 等），这类细胞对补体不敏感，阳性对照组不会出现明显损伤，实验直接无效。优先人选 PBMC、原代 T 细胞；备选原代内皮细胞、原代肾小管上皮等。
2. 细胞本身状态必须优良：活力≥90%、无支原体污染。如果细胞本身凋亡、碎片多，会掩盖 / 混淆补体造成的损伤差异。
3. PBMC 尽量新鲜分离，冻存复苏后的 PBMC 敏感性会下降；复苏后建议静置恢复数小时再铺板。

二、血清样本与分组质控

1. 所有血清来自同一原始批次，消除血清批次本身差异带来的干扰；仅热处理条件不同。
2. 三组血清预处理保持一致：解冻方式、混匀方式、分装体积，不要有的反复冻融、有的新鲜使用。
3. 血清终浓度统一（常规 10%），不要各组血清比例不一样；培养基基础成分完全相同，仅更换血清。
4. 必须设置**阳性对照（未灭活原血清），这是实验是否有效的核心判定依据；若无阳性对照，无法区分是灭活合格还是细胞本身不敏感。
5. 空白孔（无细胞培养基）必不可少，用于 LDH 本底校正。

三、铺板与培养条件

1. 细胞铺板密度要合适：PBMC 推荐 1×10⁶ cells/mL，密度太高会发生细胞自发凋亡，密度过低信号弱。每组≥3 个技术复孔，用于统计学判断。
2. 孵育时间严格控制在16~24 h。时间太短补体损伤未充分显现；超过 24 h 敏感细胞会发生自发性凋亡、坏死，无法区分是补体残留还是体外培养应激。
3. 培养箱环境稳定：37℃、5% CO₂、饱和湿度，避免温度波动、酸碱波动带来额外细胞应激。
4. 加样动作轻柔，不要吹打造成机械性细胞破损，否则 LDH 假性升高。

四、检测指标与判读要点

1. 镜下观察要盲态记录，重点对比漂浮死细胞、碎片、细胞皱缩，不要主观预判结果。
2. 台盼蓝计数：收集全部上清 + 贴壁细胞（敏感细胞shou损后会漂浮，只收集上清或者只消化贴壁细胞会低估损伤）。
3. LDH 检测：上清取样时不要吸到细胞沉淀；取样后及时检测或分装冻存，避免 LDH 降解；计算时要扣除空白本底。
4. 实验有效性前置判断：只有阳性对照组相比标准灭活组出现显著活率下降、LDH 升高，本次实验数据才可信；如果阳性对照无明显损伤，直接判定本次验证无效，需要更换更敏感细胞重做，不能得出 “待测血清合格” 结论。

五、污染与其他干扰因素

1. 全程严格无菌，细菌 / 支原体污染会造成细胞死亡、LDH 上升，完全掩盖补体效应。如果后续发现污染，数据作废。
2. 避免内毒素干扰：培养基、耗材尽量低内毒素级别；内毒素可直接激活免疫细胞，造成细胞损伤、细胞因子释放，和补体效应混淆。
3. 不要额外添加刺激剂（如 PHA、LPS），本实验只单纯检测血清残留补体的基础细胞毒性。