检测原理

试剂盒组成

• 预包被板：表面已包被抗小鼠 S1PR3 抗体的微孔板，是反应的固相载体。
• 标准品：一系列已知浓度的小鼠 S1PR3 蛋白标准品，用于制作标准曲线，一般包括 6 - 8 个不同浓度梯度。
• 生物素标记抗体：即抗小鼠 S1PR3 的生物素标记二抗，能与 S1PR3 抗原特异性结合，并且带有生物素基团，可与亲和素 - HRP 结合物结合。
• 亲和素 - HRP 结合物：含有与生物素具有高度亲和力的亲和素以及辣根过氧化物酶，用于催化底物显色。
• 底物溶液：通常为 TMB 等过氧化物酶底物，在 HRP 的作用下会发生颜色变化，如从无色变为蓝色，再在终止液作用下变为黄色。
• 洗涤缓冲液：多为含吐温 - 20 的磷酸盐缓冲液（PBS - T），用于洗涤微孔板，去除未结合的物质，以减少非特异性吸附和背景干扰。
• 终止液：一般为硫酸溶液，用于终止底物显色反应，使颜色稳定，便于酶标仪读数。
• 说明书：详细介绍了试剂盒的使用方法、操作步骤、注意事项、储存条件等信息。

操作步骤

1. 样本收集与处理：根据实验需求收集小鼠的血清、血浆、细胞培养上清或组织匀浆等样本。血清和血浆样本需离心去除杂质，组织匀浆需按照一定的方法制备并离心取上清液，细胞培养上清直接收集即可。样本收集后若不能立即检测，需按要求保存于合适的温度（如 - 20℃或 - 80℃）。
2. 准备试剂：将试剂盒从冷藏环境中取出，平衡至室温。按照说明书要求，将所需试剂如生物素标记抗体、亲和素 - HRP 结合物等进行适当的稀释。
3. 加样：将标准品和处理后的样本加入到预包被板的微孔中，每个样本和标准品设复孔，一般每孔加入 100μL 或其他规定体积的液体。轻轻振荡微孔板，使液体充分混合，然后在规定的温度（如 37℃）下孵育一定时间（如 1 - 2 小时），让样本中的 S1PR3 与包被抗体充分结合。
4. 洗涤：孵育结束后，倒掉微孔中的液体，用洗涤缓冲液洗涤微孔板。一般洗涤 3 - 5 次，每次浸泡一定时间（如 3 - 5 分钟），然后拍干或甩干微孔板，以去除未结合的物质。
5. 加二抗：向每个微孔中加入稀释好的生物素标记抗体，每孔加入适量体积（如 100μL），轻轻振荡混匀，在规定温度下孵育一段时间（如 1 小时），使二抗与结合在包被抗体上的 S1PR3 抗原结合。
6. 洗涤：同步骤 4，再次用洗涤缓冲液洗涤微孔板，以去除未结合的二抗和其他杂质。
7. 加亲和素 - HRP 结合物：加入稀释好的亲和素 - HRP 结合物，每孔加入一定体积（如 100μL），轻轻振荡，在规定温度下孵育适当时间（如 30 - 60 分钟），使 HRP 连接到复合物上。
8. 洗涤：重复步骤 4 的洗涤操作，以去除未结合的亲和素 - HRP 结合物。
9. 显色：向每个微孔中加入底物溶液，每孔加入适量体积（如 100μL），轻轻振荡混匀，在避光条件下室温孵育一段时间（如 15 - 30 分钟），观察颜色变化。随着 HRP 催化底物反应，微孔中的溶液会逐渐显色。
10. 终止反应：当颜色变化达到合适的程度时，向每孔加入终止液，一般每孔加入 50μL 或其他规定体积，轻轻振荡混匀，终止显色反应。此时溶液的颜色会稳定下来，如从蓝色变为黄色。
11. 读数：立即将微孔板放入酶标仪中，在规定的波长下（如 450nm）测定各孔的吸光度值。
12. 结果计算：根据标准品的浓度和对应的吸光度值绘制标准曲线，然后根据样本的吸光度值从标准曲线上查得相应的浓度，即为样本中 S1PR3 的含量。也可使用酶标仪自带的软件进行标准曲线拟合和样本浓度计算。

注意事项

• 试剂盒应在规定的温度下储存和使用，避免反复冻融。
• 操作过程中应严格按照说明书的要求进行加样、孵育、洗涤等操作，确保实验的准确性和重复性。
• 洗涤过程要充分，避免残留杂质影响实验结果，但也要注意避免过度洗涤导致抗体或抗原的丢失。
• 加样时要准确，尽量避免交叉污染，使用不同的移液器吸头分别吸取标准品、样本和试剂。
• 底物溶液应在使用前新鲜配制，避免长时间暴露在空气中，且显色反应应在避光条件下进行。
• 实验中使用的所有试剂和样本都应视为潜在的生物危害物质，按照相关规定进行处理，避免接触皮肤和误食。