猪（Porcine）圆环病毒3型抗体（PCV-3-Ab）

ELISA检测试剂盒

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断

检测原理

试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被猪圆环病毒3型病毒抗原的包被微孔中，依次加入标本、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中猪圆环病毒3型抗体（PCV-3-Ab）病毒的存在与否。

样品收集、处理及保存方法

1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1.  试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.  预处理后的样本请按照操作步骤用样本稀释液适当稀释以达到试剂盒的的 检测效果。

4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

名称	96孔配置	48孔配置	备注
微孔酶标板	12孔×8条	12孔×4条	无
阴性对照	0.5mL	0.5mL	无
阳性对照	0.5mL	0.5mL	无
检测抗体-HRP	10mL	5mL	无
20×洗涤缓冲液	25mL	15mL	按说明书进行稀释
样本稀释液	6mL	3mL	无
底物A	6mL	3mL	无
底物B	6mL	3mL	无
终止液	6mL	3mL	无
封板膜	2张	2张	无
说明书	1份	1份	无
自封袋	1个	1个	无

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置阴、阳性对照孔和样本孔，阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照各50μL；

3.  待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4.  随后阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

 1.  试验有效性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；

                阴性对照孔OD值平均值≤0.15。

2.  临界值（Cut off）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15

3.  阴性判断：样品OD值＜临界值（Cut off），样品为阴性

4.  阳性判断：样品OD值＞临界值（Cut off），样品为阳性

试剂盒性能

1.  准确性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；阴性对照孔OD值平均值≤0.15，说明试验结果有效。

2.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

3.  重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

4.  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

5.  有效期：6个月

免责声明

1.   试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

2.   严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。

双抗夹心法是 ELISA 中最常用的定量检测技术，核心是通过两种特异性抗体 “捕获 + 检测” 目标抗原，实现高灵敏度、高特异性的定量分析。

一、核心原理
包被：将针对目标抗原的捕获抗体（ 抗体）固相化到酶标板微孔内壁，形成固相抗体。
结合抗原：加入待测样本或标准品，样本中的目标抗原与固相捕获抗体特异性结合，形成 “固相抗体 - 抗原” 复合物，洗涤去除未结合的杂蛋白。
结合检测抗体：加入酶标记的检测抗体（ 抗体，与捕获抗体识别抗原的不同表位），检测抗体与抗原另一端结合，形成 “固相抗体 - 抗原 - 酶标检测抗体” 的夹心复合物，再次洗涤去除游离检测抗体。

显色与定量：加入酶底物（如 TMB、OPD），酶（常用 HRP、AP）催化底物显色，显色强度与样本中抗原浓度正相关。加入终止液终止反应后，用酶标仪检测吸光度，通过标准曲线计算样本中抗原的具体浓度。

二、关键特点
特异性高：两种抗体均针对目标抗原，且识别不同表位，交叉反应风险低，能有效排除杂蛋白干扰。
灵敏度强：夹心结构可放大信号，酶催化反应进一步增强检测信号，能检出低至 pg/mL 或 ng/mL 级别的抗原。
适用范围广：仅适用于具有两个及以上抗原表位的大分子抗原（如蛋白质、多肽、病毒颗粒等），无法检测小分子抗原（无足够表位结合两种抗体）。
定量准确：标准曲线线性关系良好，可通过梯度浓度标准品精准推算样本中抗原浓度，重复性佳（板内 / 板间 CV 通常＜10%-15%）。

三、核心操作流程
包被：用包被缓冲液（如碳酸盐缓冲液 pH9.6）稀释捕获抗体，加入酶标板，4℃孵育 12-16 小时或 37℃孵育 2 小时，洗涤 3-5 次。

封闭：加入封闭液（如 5% 脱脂奶粉、BSA），37℃孵育 1-2 小时，封闭未结合抗体的空白位点，洗涤去除多余封闭液。

加样反应：加入梯度浓度标准品和待测样本，37℃孵育 1-2 小时，让抗原与捕获抗体充分结合，洗涤去除未结合抗原。

加检测抗体：加入酶标记的检测抗体，37℃孵育 1 小时，洗涤去除游离检测抗体。

显色：加入底物溶液，37℃避光孵育 10-30 分钟（根据试剂盒要求调整），观察显色情况。

终止与检测：加入终止液（如硫酸溶液），15 分钟内用酶标仪在对应波长（如 TMB 底物检测波长 450nm）读取吸光度。

结果计算：以标准品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，代入样本吸光度值计算抗原浓度。

四、关键注意事项
抗体选择：捕获抗体与检测抗体需配对使用，确保识别抗原的不同表位，避免交叉竞争影响结合。

洗涤步骤：每步反应后需充分洗涤（用 PBST 缓冲液），避免未结合物质残留导致背景偏高或假阳性。

反应条件控制：严格控制孵育温度、时间，底物显色需避光，终止后及时检测，避免显色过度或褪色。

试剂质量：抗体、酶标记物、底物需在有效期内储存使用，避免因试剂失效影响检测结果。

选择 ELISA 试剂盒需围绕 “检测目标、样本类型、实验需求、产品性能” 四大核心，兼顾准确性、适用性和性价比，避免盲目选型。

锁定检测目标：精准确认目标抗原 / 抗体（如大鼠 PDCD1LG1、人 IL-6），明确物种（人 / 大鼠 / 小鼠等）和检测类型（定量 / 定性），避免物种或指标错配。

匹配样本类型：根据实验室样本（血清 / 血浆 / 组织匀浆 / 细胞上清等）选择，优先选明确标注 “适配该样本类型” 的试剂盒，部分试剂盒需特殊样本预处理，需提前确认操作可行性。

明确检测范围与灵敏度：按样本中目标物浓度估算，试剂盒检测范围需覆盖样本预期浓度（如样本浓度约 10-100ng/mL，选择检测范围 5-200ng/mL 的试剂盒），灵敏度需低于样本 预期浓度，避免无法检出或超出量程。

特异性：优先选标注 “无交叉反应” 或 “交叉反应率＜5%” 的试剂盒，确保不与样本中其他类似物质发生干扰，尤其检测复杂样本（如组织匀浆）时需重点关注。

重复性：查看产品说明中板内 / 板间变异系数（CV）， 试剂盒板内 CV＜10%、板间 CV＜15%，保证实验结果稳定可靠。

线性关系：标准曲线相关系数 R2≥0.99 为合格，线性越好，定量结果越精准，避免因线性不佳导致浓度推算误差。

方法学类型：双抗夹心法（适用于大分子抗原，特异性高、灵敏度强）、间接法（适用于小分子抗原或抗体检测）、竞争法（适用于小分子或半抗原），按检测目标特性选择。

实验周期与操作复杂度：快速检测需求可选 “一步法” 或 “短孵育时间（如 30 分钟 / 孔）” 的试剂盒；新手或高通量检测需选操作流程简单、步骤少的产品，减少人为误差。

合规与溯源需求：临床检验、药物研发等合规场景，需选带 CE、FDA 认证或符合 ISO 15189 标准的试剂盒；科研场景可选择性价比高的科研级产品，但需确保性能参数明确。

试剂稳定性与储存条件：优先选有效期≥6 个月、储存条件宽松（如 2-8℃避光，无需 - 20℃冷冻）的试剂盒，避免因试剂易失效或储存不便影响使用。

成本预算：在满足性能要求的前提下，平衡单价与单次检测成本（部分试剂盒可拆分使用，适合小样本量实验室），避免过度追求高价产品或因 导致结果不可靠。

试剂盒组成完整性：确认包含酶标板、标准品、抗体、底物、终止液、洗涤液等核心组分，是否需额外自备辅助试剂（如封闭液），避免后续采购麻烦。

品牌与用户口碑：选择市场认可度高、有明确技术支持的品牌，可参考同领域文献中常用试剂盒型号，或咨询同行实验室推荐，减少踩坑风险。

售后支持：优先选提供技术咨询、异常结果排查指导的品牌，部分厂家可提供试用装，适合 使用该试剂盒的实验室验证性能。

上海笃玛生物科技有限公司