BCA蛋白定量｜一张图看懂原理+步骤，附避坑指南

BCA蛋白定量｜一张图看懂原理+步骤，附避坑指南

做细胞裂解、蛋白提取后，最怕的就是蛋白浓度测不准——Western上样量不一致，结果没眼看。

今天用一张图帮你搞懂BCA定量的原理和操作流程，顺便把常踩的坑也列出来。

BCA定量原理：

碱性条件下，蛋白质将Cu2?还原为Cu?，Cu?与BCA试剂（4,4'-二羧酸-2,2'-二噻啉钠）生成紫色复合物，在562 nm处测吸光度，颜色越深，蛋白浓度越高。

优点：终产物稳定，受去垢剂干扰小（Triton X-100、SDS等均可兼容），灵敏度范围10-1200 μg/mL。

标准操作流程

1. 蛋白提取：裂解细胞或组织，离心取上清。

2. 配制BCA工作液：试剂A与试剂B按50:1混合（注意避光）。

3. 加样：在96孔板中，标准品按0、2、4、6、8μg(或0、1、2、3、4、5μg)和待测样品1μL且各自补ddH2O至25 μL，再加入200 μLBCA工作液。

4. 孵育：37℃孵育30分钟（或室温2小时），溶液变紫色。

5. 测吸光度：酶标仪562 nm读数，绘制标准曲线，计算样品浓度。

 6个注意事项｜避免翻车

加样前可先计算好稀释液的量，在加入样品和标准品前把稀释液加入96孔板中，然后再加样品和标准品

——可以减少加入样本与标准品的损耗。

标准品和样品用同一种稀释液(一般为ddH2O)

——裂解液不同会改变显色背景，务必用相同的缓冲液稀释。

BCA工作液要新鲜配制

——试剂B（CuSO?）与A混合后1小时内用完，久置会自发显色。

孵育温度要一致

37℃显色快，室温慢。标准和样品必须在相同温度、相同时间孵育。

——加样后轻轻敲板，或用针尖挑破气泡，否则读数波动很大。

还原剂会严重干扰

——DTT、β-巯基乙醇等还原剂会还原Cu2?，导致结果偏高。若裂解液含还原剂，改用Bradford法或提前透析/稀释。

小贴士

如果样品浓度太高（>1200 μg/mL），先稀释再测，最后乘以倍数。

每次实验都做标准曲线，不要用上次的数据。

562 nm是最大吸收峰，但部分酶标仪可用560-570 nm，影响不大。