双抗夹心法原理+步骤+注意事项

做ELISA的你，是不是经常听到“双抗夹心法”这个词，但具体怎么操作、每一步在干什么，还是有点模糊？

其实它的核心逻辑不复杂，说到底就是用两个抗体把目标蛋白“夹”在中间。

双抗夹心法原理

板底预先包被了捕获抗体，它会特异性识别并结合目标抗原。洗掉未结合的杂质后，加入一抗，一抗会与目标抗原的另一个表位结合，形成“捕获抗体-抗原-一抗”的夹心结构。接着加入生物素标记的抗体，它会结合一抗，最后链霉亲和素-辣根过氧化物酶通过生物素-亲和素系统连接到复合物上。加入TMB底物后，HRP催化底物显色，颜色深浅与目标蛋白浓度成正比。

实验步骤

1?? 加样：将样本加入已包被捕获抗体的微孔板中，目标抗原与捕获抗体结合。
2?? 洗板：洗掉未结合的杂质。
3?? 加一抗：一抗识别并结合目标抗原的另一个表位，形成夹心结构。
4?? 加生物素标记抗体：生物素标记抗体与一抗结合，起到信号放大作用。
5?? 显色与读数：加入链霉亲和素-HRP催化TMB底物显色，加终止液终止反应后，酶标仪读取OD值。

?? 注意事项

试剂回温：试剂用前室温平衡20分钟，洗涤液按说明书精确稀释。

加样：枪头勿碰孔底，标准品和样本设复孔，加样顺序一致避免时间差。

洗板（最关键）：每次拍干至无液体残留，洗板次数和浸泡时间保持一致——背景高90%是洗板没做好。

孵育与显色：孵育时盖膜防边缘效应，显色避光，终止液加完15分钟内读数。

标准曲线：用四参数拟合（R2≥0.99），高浓度样本稀释后再测，确保OD值落在标准范围内。

一句话总结

ELISA双抗夹心法就是用两个抗体“夹住”目标蛋白，通过酶促显色反应将抗原浓度转化为可读的OD值。每一步操作都影响最终结果，尤其是洗板环节——背景高，先查洗板。

有用的话点赞收藏，下次做实验前翻出来看一眼。