小鼠鞘氨醇1磷酸酯受体4(S1PR4) ELISA 试剂盒

酶联免疫吸附实验 (ELISA) 是一种定性或定量检测，使用抗体来结合并测定目的分子。与其他免疫检测相似，可使用单克隆抗体和多克隆抗体来检测分析物（如肽、蛋白、抗体和小分子）。抗体对分析物产生特异性，并且一部分（如辣根过氧化物酶 [HRP]）直接或间接偶联抗体，从而提供检测方法并实现可能的信号放大。通过多种ELISA方法和检测化学成份，可以让终端用户调整适当的检测，以解决预计的实验问题。该方法可以用于单份样品检测或高通量筛选。

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直接 ELISA

在直接 ELISA 中，抗原直接结合微孔板表面，随后添加直接偶联的抗体来结合/检测。简而言之，实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂，防止检测抗体出现非特异性结合。接下来，添加直接偶联某种酶（如 HRP）的检测抗体。该检测抗体将结合抗原，并且剩余的抗体会从孔中洗掉。随后添加这种酶的底物，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。直接 ELISA 的实验步骤有限，可让实验设置整体简化。

直接法优缺点：

优点：1：快速，仅使用一种抗体且步骤较少；2：消除了 抗体的交叉反应性。

缺点：1：一抗的免疫反应性可能受到酶或标签标记的不利影响；2：为每个特定的ELISA系统标记一抗，既费时又昂贵；3：由于标记的抗体密度较低导致较低的灵敏度；4：抗原的固定化不是特异性的，有较高背景干扰。

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间接 ELISA

间接 ELISA 类似于直接 ELISA；但主要的差别在于会通过 偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂，防止结合抗体出现非特异性结合。第三，添加一种抗原特异性结合抗体，短暂孵育后，用缓冲液洗涤板孔，以去除多余的试剂。下一步是“间接”检测，其中添加一种抗体来检测 结合抗体。这种抗体通常偶联某种酶。在孵育和洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。 抗体通常是一种抗物种抗体。间接 ELISA 的主要优势在于可以使用偶联的 抗体来进行多个实验，前提是在所有不同的实验中使用相同物种的结合抗体。另一个优势是 抗体会放大信号，因为大约 2 个抗体将结合 抗体。随着步骤数量的增加，实验步骤通常会耗时更长，并且更容易出错。此外，背景信号可能会增强，因为所需的试剂数量更多，每一种都可能会出现非特异性结合。

间接法优缺点：

优点：1：可以在一个物种中制备许多一抗，并且可以将相同的标记二抗用于检测；2：由于没有标记，保留了 抗体的 免疫反应性；3：高标记的二抗密度可实现高灵敏度，从而导致信号放大。

缺点：1：二抗可能会发生交叉反应，从而导致非特异性信号；2：这个过程中需要一个额外的孵育步骤

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夹心法 ELISA

在夹心 ELISA 中，抗原成为 2 种抗体之间的“三明治”中心。在一种夹心 ELISA 形式中， 抗体被吸收进入微孔板孔中，在洗涤和封闭后，添加含抗原的样品。添加会结合样品分子另一位点的 抗体。这种 抗体通常偶联某种酶，因此它可用来检测。洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂反应孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。

夹心法优缺点：

优点：1：高特异性，使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的；2：适用于复杂样品，抗原不需要进行纯化即可用于检测；3：灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接法也可采用间接法。

缺点：1：检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位：2：价格较贵，时间消耗多。

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竞争性ELISA

竞争性/抑制性 ELISA 也称封闭 ELISA，它对干扰预计信号的程度进行定量，以测定分析物的数量。这样做的一个方法是用一种对靶标有特异性的抗体包被平板。靶标可以偶联某种酶，并用于检测。如果实验含有次于 量的检测靶标，则高浓度的未标记靶标会竞争性地结合，从而减弱信号。这类竞争性实验可用来测定某种特异性分析物的水平。

竞争法优缺点：

优点：1：灵敏度高以及灵活性高；2：能测定微量的分析物。

缺点：1：特异性较低；2：需要酶标记的抗原。

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注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间 控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线， 做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请 乘以稀释倍数。
6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

⑵ 结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。
HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
结合物中酶总量=HRP（mg/ml）×结合物溶液量
结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果 。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时 。酶结合率为 7%时效果一般，为9%－10%较好，达30%以上时 。

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