双抗夹心法是 ELISA 中最常用的定量检测技术，核心是通过两种特异性抗体 “捕获 + 检测” 目标抗原，实现高灵敏度、高特异性的定量分析。

显色与定量：加入酶底物（如 TMB、OPD），酶（常用 HRP、AP）催化底物显色，显色强度与样本中抗原浓度正相关。加入终止液终止反应后，用酶标仪检测吸光度，通过标准曲线计算样本中抗原的具体浓度。

二、关键特点
特异性高：两种抗体均针对目标抗原，且识别不同表位，交叉反应风险低，能有效排除杂蛋白干扰。
灵敏度强：夹心结构可放大信号，酶催化反应进一步增强检测信号，能检出低至 pg/mL 或 ng/mL 级别的抗原。
适用范围广：仅适用于具有两个及以上抗原表位的大分子抗原（如蛋白质、多肽、病毒颗粒等），无法检测小分子抗原（无足够表位结合两种抗体）。
定量准确：标准曲线线性关系良好，可通过梯度浓度标准品精准推算样本中抗原浓度，重复性佳（板内 / 板间 CV 通常＜10%-15%）。

三、核心操作流程
包被：用包被缓冲液（如碳酸盐缓冲液 pH9.6）稀释捕获抗体，加入酶标板，4℃孵育 12-16 小时或 37℃孵育 2 小时，洗涤 3-5 次。

封闭：加入封闭液（如 5% 脱脂奶粉、BSA），37℃孵育 1-2 小时，封闭未结合抗体的空白位点，洗涤去除多余封闭液。

加样反应：加入梯度浓度标准品和待测样本，37℃孵育 1-2 小时，让抗原与捕获抗体充分结合，洗涤去除未结合抗原。

加检测抗体：加入酶标记的检测抗体，37℃孵育 1 小时，洗涤去除游离检测抗体。

显色：加入底物溶液，37℃避光孵育 10-30 分钟（根据试剂盒要求调整），观察显色情况。

终止与检测：加入终止液（如硫酸溶液），15 分钟内用酶标仪在对应波长（如 TMB 底物检测波长 450nm）读取吸光度。

结果计算：以标准品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，代入样本吸光度值计算抗原浓度。

四、关键注意事项
抗体选择：捕获抗体与检测抗体需配对使用，确保识别抗原的不同表位，避免交叉竞争影响结合。

洗涤步骤：每步反应后需充分洗涤（用 PBST 缓冲液），避免未结合物质残留导致背景偏高或假阳性。

反应条件控制：严格控制孵育温度、时间，底物显色需避光，终止后及时检测，避免显色过度或褪色。

试剂质量：抗体、酶标记物、底物需在有效期内储存使用，避免因试剂失效影响检测结果。

选择 ELISA 试剂盒需围绕 “检测目标、样本类型、实验需求、产品性能” 四大核心，兼顾准确性、适用性和性价比，避免盲目选型。

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