海藻糖-6-磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphate- Synthase ，TPS）  试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

海藻糖是由两个葡萄糖分子以α ， α- 1- 1 糖苷键连接而成的一种非还原双糖， 广泛存

在于细菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆虫、 无脊椎动物和高等植物等多种有机体

中。 海藻糖的非还原性决定了它对酸、碱、高温等的稳定性。 另外， 它本身具有很强的吸水

性， 使它在生物体内具有抗脱水作用， 在逆境条件下可通过识别外界刺激、产生和传递信号、

基因表达和代谢调节来保护植物免受不良环境的伤害。

植物体内主要以葡萄糖为底物合成海藻糖，该反应首先在海藻糖-6-磷酸合成酶

（trehalose-6-phosphate synthase ，TPS）的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和 6-

磷酸葡萄糖反应生成中间产物6-磷酸海藻糖， 再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶 （trehalose

6-phosphatephosphatase ，TPP）的作用下去磷酸化，生成海藻糖。因此，测定TPS活性对于

研究植物逆境具有重要意义。

测定原理：

TPS 催化 UDPG 与 G6P 生成海藻糖-6-磷酸，同时产生 UDP；UDP 在丙酮酸激酶与乳 酸脱氢酶作用下， 氧化 NADH 为NAD+，NADH 的下降速率与 UDP 含量成正比， 通过 340nm

吸光度下降速率反映 TPS 活性。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、水浴锅、可调式移液器、 96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂一： 粉剂×1 瓶， -20℃保存； 临用前加入 12mL 试剂五溶解，用不完的试剂分装后-20℃ 保存，禁止反复冻融；

试剂二： 粉剂×2 瓶， -20℃保存； 临用前每瓶加入 10mL 试剂五溶解，现配现用；

试剂三： 粉剂×1 瓶， -20℃避光保存； 临用前加入 0.1mL 试剂五溶解，用不完的试剂分装后 -20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四： 100μL×1 瓶， 4℃避光保存； 临用前低速离心， 以防止试剂沾在管壁； 试剂五：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

工作液的配制： 临用前， 先配置好试剂二和试剂三， 然后取试剂二一瓶， 加入 10μL 试剂三 和 10μL 试剂四， 充分混匀，现配现用。

样品测定的准备：                                                      1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104 个）： 提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液）， 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30 次） ；8000g ，4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。

2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液） ，冰浴中匀浆。 8000g  ，4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。

测定步骤

1 、在 EP 管中加入如下试剂

试剂名称（μL）	测定管
样本	100
试剂一	100

混匀， 30℃反应 20min ，95℃水浴 2min 灭活， 冷却至室温。 10000g 4℃离心 5min，取上层 反应液待测

2、工作液配制：详见试剂的组成和配制中工作液的配制。

3、在 96 孔板中加入如下试剂

反应液	20
工作液	180

混匀，测定 340nm 下反应 5min 后的吸光值 A1 与 10min 后的吸光值 A2 ，ΔA=A1-A2。

TPS 活力计算：

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

TPS 活力(nmol/min/mg prot)=ΔA×V 反总÷（ ε×d）×109÷（V 样×Cpr）÷T×10

=1286×ΔA ÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

TPS 活力(nmol/min/g  鲜重)=ΔA×V 反总÷（ε×d）×109÷（W× V 样÷V 样总） ÷T×10

=1286×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 TPS 活力(nmol/min/104 cell)=ΔA×V 反总÷（ε×d）×109÷（V 样×细胞数量） ÷T×10

=2.57×ΔA

V  反总：反应体系总体积， 0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数， 6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径， 0.5cm；V 样：加入样本体积， 0.1  mL；V 样总： 加入提取液体积， 1  mL；T： 反应时间， 5 min；10，稀释倍数； Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量；细胞数 量， 500 万。

1、如果提供提取物，该如何提取（能否用有机溶剂）植物细胞分裂素（Cytokinin）elisa试 剂盒？ 答：这个一般参考文献即可有机溶剂是可以添加的，但一般的叶片匀浆，我们采取的是10%的组织匀浆，匀浆液用PBS就行了

2、植物细胞分裂素（Cytokinin）elisa试剂盒   再请问细胞分裂素标样用什么稀释？估计占用几个孔？每份待测样品需要提供多少体积？有些方法中会用到C18柱萃取，我知道C18柱也占一定费用

3、瘤中的激素按照实验原理来看，检测中肯定可以检测，但需要进行PH值的控制 需要PBS进行缓冲

4、鸡血清一氧化氮(NO)定量检测试剂盒(ELISA）和鸡组织一氧化氮(NO)定量检测试剂盒 (ELISA）是同一个吗？   可以的

5、小鼠白蛋白（ALB）Elisa试剂盒   我样品是肝细胞种植在材料上的，我问下你们 限度是纳克级别的是吧？有没有换算成细胞数目的呢？

6、可否不包被？ 不可以

8、我就是想问一下，测定青霉和曲霉产生的P450用人和大鼠P450的试剂盒可以吗啊？

可以 蛋白结构一样

9、你们的试剂对样品有什么特殊要求吗?做血清环磷酸腺苷\鸟苷两项共须多少血,用普 通的试管抽取后-20保存就可以了吗? 普通试管就行，如果 长时间保存的话，建议保存-80，-20保存时限为1个月

10、每个样需要提供50ul标本   首先老师选取的样本是血清还是血浆?

做血清环磷酸腺苷\鸟苷两项共须多少血

2个指标的话需要血清为100微升，全血对半损失，全血200微升

10、请问：1、用你们的环磷酸腺苷、鸟苷试剂盒,样品血一定需要离心

20分钟吗？请给我一个准确的时间。（我请教了一位临床检验专业的人士，说     其实 他们临床只转几分钟，）会影响效果吗？是否需要低温？

答：在离心时候，理论规范是充分离心，大多数以20分钟为宜  但转数有严格的限定，不能超过3000转，离心低温只针对少数指标而言，大部分指标不需要低温离心，老师测定的这2个指标不需要低温离心

11、小鼠的cckelisa试剂盒样本有72个样品量要多少？答：做复孔的话，100微升单孔的话， 50微升

血浆中的浓度比较低。与HPLC方法比较，ELISA方法哪个检出限比较低？ HPLC 13、帮我问一下吧！鼠的检测Noggin的试剂盒是用酶联免疫的还是免疫组化的好（都可以 测出Noggin吗 我是指在镜下都可以观察到吗）

14、代测一个样品最少需要多少克？ 组织样本处理50mg 最少加样为50微升

测4个指标

每个样最少寄来100ul15、测鱼的肝脏组织，处理样品，用的PBS的浓度是多大的？

PBS（PH7.2-7. 16、大鼠TSH试剂盒 （如果往血清里放入叠氮钠，是否会影响检测？如果能加，加多少呢？ 答：不能加，对实验结果又干扰

15：大鼠TSH试剂盒往血清里加什么保护剂？就是不让蛋白降解 不染菌 同时不影响结果不需要加，直接血清冻存即可

16、客户的老鼠分8个组，每个组需要几只老鼠，共要多少样本。共测4个指标96T的。   这个看老师自己组别分组，我们建议每组不少于10只，样本越多，越利于统计 血液不分

血和动脉血

17、间断收集需要离心后保存 全血不易保存和运输

可以间断寄标本过来，我们实验室代处理可以分次离心帮忙保存

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