检测原理

试剂盒组成

• 预包被板：通常为 96 孔或 48 孔的微孔板，表面已预包被抗人 SPARC 抗体，用于特异性捕获样本中的 SPARC 蛋白。
• 标准品：一系列已知浓度的人 SPARC 蛋白标准品，用于绘制标准曲线，以便对样本中的 SPARC 进行定量分析。
• 酶标工作液：含有辣根过氧化物酶（HRP）等标记的抗人 SPARC 抗体，能够与结合在包被抗体上的 SPARC 蛋白特异性结合，形成可被检测的复合物。
• 底物溶液：如四甲基联苯胺（TMB）溶液，在 HRP 的催化作用下会发生显色反应，通常为无色透明液体，显色后可通过酶标仪进行检测。
• 终止液：一般为硫酸溶液，用于终止底物的显色反应，使溶液颜色稳定，便于准确测量吸光度值。
• 样本稀释液：用于稀释血清、血浆、细胞培养上清等样本，使样本中 SPARC 的浓度处于试剂盒的 检测范围内，同时保证样本的酸碱度和离子强度等条件适合检测。
• 洗涤液：多为含有吐温 - 20 的磷酸盐缓冲液（PBS - T），用于洗涤微孔板，去除未结合的物质，减少非特异性吸附，以提高检测的准确性。

操作步骤

1. 试剂准备：从冰箱中取出试剂盒中的各组分，平衡至室温。按照说明书要求配制标准品稀释液、样本稀释液、酶标工作液和洗涤液等。
2. 加样：将标准品和待测样本加入到预包被板的相应孔中，通常设置复孔，以减少误差。同时设置空白对照孔，只加样本稀释液，不加样本和标准品。
3. 温育：将微孔板放入恒温箱中，按照说明书规定的温度和时间进行温育，使样本中的 SPARC 蛋白与包被抗体充分结合。
4. 洗涤：温育结束后，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤微孔板多次，每次洗涤后要拍干板内液体，以去除未结合的物质。
5. 加酶标工作液：向各孔中加入适量的酶标工作液，确保酶标抗体能够与结合在包被抗体上的 SPARC 蛋白特异性结合。
6. 温育与洗涤：再次进行温育，使酶标抗体与抗原充分结合，然后重复洗涤步骤，去除未结合的酶标抗体。
7. 显色：加入底物溶液，在酶的催化作用下，底物发生显色反应。将微孔板在避光条件下放置一段时间，让颜色充分发展。
8. 终止反应：加入终止液，终止显色反应，此时溶液颜色不再变化。
9. 读数：使用酶标仪在规定的波长下测定各孔的吸光度值。根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，再根据待测样本的吸光度值从标准曲线上计算出其 SPARC 的浓度。