检测原理

• 一般采用双抗体夹心法。试剂盒中的微孔板预先包被有针对人 RPA - 70 的特异性抗体。当加入待测样本时，样本中的 RPA - 70 抗原会与包被抗体结合。随后加入酶标记的另一种抗人 RPA - 70 抗体，它会与已结合在包被抗体上的 RPA - 70 抗原形成特异性的 “三明治” 结构。加入底物后，酶标抗体上的酶催化底物发生反应，产生有色产物。通过酶标仪测定吸光度值，吸光度与样本中 RPA - 70 的含量成正比，从而可以根据标准曲线计算出样本中 RPA - 70 的浓度。

试剂盒组成

• 预包被板：通常为 96 孔或 48 孔的微孔板，表面牢固地包被有高亲和力的抗人 RPA - 70 抗体，用于捕获样本中的 RPA - 70 抗原。
• 标准品：一系列已知浓度的人 RPA - 70 蛋白标准品，如 0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 等不同浓度梯度，用于构建标准曲线，以便对样本中的 RPA - 70 进行定量分析。
• 酶标工作液：含有用特定酶（如辣根过氧化物酶 HRP）标记的抗人 RPA - 70 抗体，能够特异性地识别并结合 RPA - 70 抗原，在后续步骤中催化底物显色。
• 底物溶液：常用的底物如四甲基联苯胺（TMB），在酶的作用下会发生显色反应，生成蓝色产物，加入终止液后变为黄色，便于进行吸光度检测。
• 终止液：一般为硫酸溶液，用于快速终止底物的显色反应，使反应体系的颜色稳定，以便准确测量吸光度值。
• 样本稀释液：用于稀释血清、血浆、细胞裂解液等样本，使样本中的 RPA - 70 抗原处于合适的浓度范围，同时保证样本的稳定性和反应活性。
• 洗涤液：通常是含有吐温 - 20 等表面活性剂的磷酸盐缓冲液（PBS - T），用于在实验过程中洗涤微孔板，去除未结合的物质，减少非特异性吸附，提高检测的准确性。

操作步骤

1. 试剂准备：将试剂盒从冰箱中取出，在室温下平衡 30 - 60 分钟。按照说明书的要求，准确配制标准品、样本稀释液、酶标工作液和洗涤液等。
2. 加样：将标准品和待测样本加入到预包被板的相应孔中，标准品一般设复孔，同时设置空白对照孔。加样时需使用移液器准确加样，避免交叉污染。
3. 温育：将微孔板放入恒温箱中，在规定的温度（如 37℃）和时间（通常 1 - 2 小时）下进行温育，使样本中的 RPA - 70 抗原与包被抗体充分结合。
4. 洗涤：温育结束后，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤微孔板 3 - 5 次，每次洗涤后将微孔板倒扣在吸水纸上拍干，以去除未结合的物质。
5. 加酶标工作液：向各孔中加入适量的酶标工作液，轻轻振荡微孔板，使酶标工作液均匀分布，确保酶标抗体与结合在包被抗体上的 RPA - 70 抗原充分结合。
6. 温育与洗涤：再次将微孔板放入恒温箱中温育，条件同前。温育结束后，重复洗涤步骤。
7. 显色：加入底物溶液，轻轻振荡微孔板，然后将其放置在避光处显色，显色时间通常为 15 - 30 分钟，具体时间可根据说明书和实际显色情况进行调整。
8. 终止反应：当显色达到合适的程度时，加入终止液，终止显色反应，溶液颜色会立即从蓝色变为黄色。
9. 读数：使用酶标仪在规定的波长下（通常为 450 nm）测定各孔的吸光度值。若酶标仪具有双波长检测功能，可同时测定 630 nm 波长下的吸光度值作为参考。根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，进而计算出待测样本中 RPA - 70 的浓度。