一、检测原理

1. 包被抗体：微孔板表面预包被针对人 SPARCL1 的特异性抗体（捕获抗体）。
2. 样本结合：加入待检样本后，样本中的 SPARCL1 与包被抗体特异性结合，形成 “抗体 - 抗原” 复合物。
3. 酶标抗体结合：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的另一种抗 SPARCL1 抗体（检测抗体），与已结合的 SPARCL1 形成 “抗体 - 抗原 - 酶标抗体” 夹心复合物。
4. 显色反应：加入底物溶液（如 TMB），HRP 催化底物生成蓝色产物，加入终止液（硫酸）后变为黄色。颜色深浅与样本中 SPARCL1 的浓度呈正相关，通过酶标仪测定吸光度（OD 值），结合标准曲线计算样本浓度。

二、试剂盒组成

三、适用样本类型

• 血清：需用不含热原和内毒素的试管采集，离心后取上清，避免溶血。
• 血浆：使用 EDTA 或肝素抗凝管采集，离心后取上清，避免反复冻融。
• 细胞培养上清：离心去除细胞碎片后直接检测或按比例稀释。
• 组织裂解液：需使用合适的裂解液提取蛋白，离心后取上清，确保蛋白浓度在检测范围内。

四、操作步骤（以 96 孔板为例）

1. 试剂准备：
   • 试剂盒从 2-8℃取出，室温平衡 30-60 分钟（标准品需解冻后混匀）。
   • 洗涤液用蒸馏水稀释 20 倍（如 10mL 20× 洗涤液 + 190mL 蒸馏水）。
2. 加样与温育：
   • 标准品 / 样本：设空白孔（加样本稀释液）、标准品孔（每浓度 2 复孔）、样本孔（按说明书稀释后加样），每孔加样 100μL，封板膜覆盖，37℃温育 60 分钟。
   • 洗板：弃液后用 1× 洗涤液注满孔，静置 30 秒，甩干，重复 3-5 次， 拍干板底。
3. 加酶标抗体：
   • 每孔加 100μL 酶标抗体工作液，37℃温育 30-60 分钟，重复洗板步骤。
4. 显色与终止：
   • 每孔加底物 A、B 液各 50μL（或混合后加 100μL），轻轻振荡，37℃避光显色 15-20 分钟（避免过显）。
   • 每孔加 50μL 终止液（硫酸），立即混匀，蓝色转为黄色。
5. 读数：
   • 酶标仪设定 450nm 波长，读取各孔 OD 值，空白孔调零。
   • 以标准品浓度为横坐标，平均 OD 值（扣除空白）为纵坐标，绘制标准曲线（建议用四参数拟合），计算样本浓度。

五、注意事项

1. 试剂盒保存：未开封试剂盒于 2-8℃保存，避免冷冻；开封后包被板需密封防潮，酶标抗体和底物需避光。
2. 样本处理：
   • 避免使用溶血、脂血或微生物污染的样本，否则可能导致背景偏高或结果偏差。
   • 样本中蛋白浓度过高时，需用样本稀释液预稀释，确保结果在标准曲线范围内（超出上限建议稀释后重测）。
3. 操作规范：
   • 加样时移液器需校准，换吸头避免交叉污染；温育时板孔需完全覆盖，避免边缘效应。
   • 洗板时需充分去除未结合物质，但避免洗涤过度导致复合物脱落（每次洗涤后拍干）。
4. 显色控制：
   • 底物需现配现用，避光操作；显色时间根据实验室温度调整（低温可适当延长，高温缩短），避免颜色过深影响线性。
5. 数据处理：
   • 标准曲线 R2 需≥0.99，复孔 OD 值 CV≤10%，否则需重新实验。
   • 若样本值高于 标准品浓度，需增加稀释倍数后重新检测。
6. 安全防护：
   • 终止液（硫酸）具有腐蚀性，避免接触皮肤和黏膜；底物 TMB 需避免吸入或接触，操作时戴手套和护目镜。