检测原理

• 抗体包被：将抗小鼠 P - Cadherin 的单克隆抗体预包被在酶标板的微孔表面。当含有 P - Cadherin 的样本加入到微孔中时，样本中的 P - Cadherin 抗原会特异性地结合到包被抗体上，形成抗原 - 抗体复合物。
• 酶标抗体结合：洗去未结合的物质后，向微孔中加入酶标记的另一种抗 P - Cadherin 的单克隆抗体。这种酶标抗体能够与已经结合在包被抗体上的 P - Cadherin 抗原的另一个抗原决定簇结合，形成 “包被抗体 - P - Cadherin - 酶标抗体” 的稳定夹心结构。
• 底物显色：再次洗涤去除未结合的酶标抗体后，加入酶的底物。酶标抗体上的酶会催化底物发生化学反应，产生有色产物。在一定的时间和条件下，颜色的深浅与样本中 P - Cadherin 的含量呈正比关系。
• 结果测定：使用酶标仪测定微孔板中溶液在特定波长下的吸光度值。通过与已知浓度的 P - Cadherin 标准品所绘制的标准曲线进行对比，从而计算出样本中 P - Cadherin 的浓度。

试剂盒组成

• 预包被板：已包被抗小鼠 P - Cadherin 抗体的微孔板，通常为 96 孔或 48 孔板。
• 标准品：一系列已知浓度的小鼠 P - Cadherin 蛋白标准品，用于制作标准曲线，一般包括 6 - 8 个不同浓度的标准品。
• 酶标工作液：含有辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等标记的抗小鼠 P - Cadherin 抗体的溶液。
• 底物溶液：根据酶的类型选择相应的底物，如 HRP 常用的底物为四甲基联苯胺（TMB），AP 常用的底物为对硝基苯磷酸酯（p - NPP）等。
• 终止液：用于终止酶促反应，如 HRP - TMB 系统常用硫酸作为终止液，使反应溶液颜色稳定，便于酶标仪读数。
• 浓缩洗涤液：通常为磷酸盐缓冲液（PBS）等，含有表面活性剂，用于洗涤微孔板，去除未结合的物质，使用时需按比例稀释。
• 样本稀释液：用于稀释样本，使样本中 P - Cadherin 的浓度处于试剂盒的检测范围内，保证检测结果的准确性。

操作步骤

1. 试剂准备：将试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温（一般为 20 - 25℃）。按照说明书要求配制洗涤液、样本稀释液等试剂。
2. 加样：将标准品、待测样本加入到相应的微孔中，同时设置空白对照孔（只加缓冲液，不加样本和试剂）。轻轻振荡混匀，在规定的温度（如 37℃）和时间（一般为 1 - 2 小时）下孵育，使抗原 - 抗体充分结合。
3. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗涤微孔板 3 - 5 次，每次浸泡 1 - 2 分钟后拍干，以去除未结合的抗原、抗体及其他杂质。
4. 加酶标工作液：向每孔中加入适量的酶标工作液，轻轻振荡混匀，在规定条件下（如 37℃，1 - 2 小时）孵育，使酶标抗体与抗原 - 抗体复合物结合。
5. 洗涤：重复步骤 4 中的洗涤操作，以去除未结合的酶标抗体。
6. 显色：加入底物溶液，轻轻振荡混匀，在避光条件下孵育（如 37℃，15 - 30 分钟），使酶催化底物反应显色。
7. 终止反应：加入终止液，轻轻振荡混匀，终止酶促反应。此时溶液颜色会发生变化，如 TMB 底物被 HRP 催化后由无色变为蓝色，加入硫酸终止液后变为黄色。
8. 读数：在规定时间内，使用酶标仪在特定波长下（如 450nm 或其他相应波长）测定各孔的吸光度值。根据标准曲线计算样本中 P - Cadherin 的浓度。

注意事项

1. 试剂盒应在规定的温度下保存，避免反复冻融和过期使用，一般保存于 2 - 8℃。
2. 实验操作过程中要严格按照说明书进行，加样要准确，使用加样器时要注意量程的选择和校准，避免交叉污染，建议使用一次性吸头。
3. 洗涤过程要充分，以减少非特异性结合，但不要过度洗涤以免影响检测结果。洗涤液要现用现配，使用干净的容器和新鲜的蒸馏水或去离子水。
4. 显色反应需要在避光条件下进行，可使用黑色的酶标板或用铝箔纸包裹酶标板，避免光线对显色的干扰。底物溶液应在使用前新鲜配制，避免长时间暴露在空气中。
5. 酶标仪的波长设置要准确，读数时间要严格按照说明书要求，以保证结果的准确性。在测定吸光度值前，应确保酶标板表面清洁，无残留液体和指纹等。
6. 对于浓度过高或过低的样本，应进行适当稀释或浓缩后再进行检测。稀释倍数应根据样本的预估浓度和试剂盒的检测范围进行合理选择，并在报告结果时注明稀释倍数。
7. 在整个实验过程中，应注意佩戴手套和口罩，避免试剂接触皮肤和口鼻，如不慎接触，应立即用大量清水冲洗。同时，试剂盒中的某些试剂可能具有腐蚀性或毒性，要妥善处理废弃物。