产品货号：DM-Cat6780

产品规格：48/96T

牛肝素因子 4 抗体（HPF4）酶联免疫试剂盒是用于科研场景定量检测牛生物样本中 HPF4 抗体含量的工具，以下是具体介绍：
基本信息规格： 48T 和 96T 两种，分别可进行 48 次和 96 次检测。
检测方法：一般采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法。
检测波长：通常使用酶标仪在 450nm 波长处进行吸光值的测量。
主要组成成分酶标包被板：通常是 96 孔板，已预包被针对牛 HPF4 抗体的特异性抗原或抗体。
标准品：一般为冻干品，有 2 - 6 瓶不等，临用前需用样品稀释液溶解并倍比稀释，以构建标准曲线。
生物素标记抗体及稀释液：含生物素标记的抗牛 HPF4 抗体及其配套稀释液。
辣根过氧化物酶标记亲和素或二抗及稀释液：用于与生物素化抗体结合，形成可实现酶促显色的反应体系。
样品稀释液：用来稀释待测的牛血清、血浆、组织匀浆等生物样本，也可用于溶解标准品。
底物溶液：多采用 TMB 底物，能在辣根过氧化物酶的催化下显色。
浓洗涤液：如 20X 或 25X 浓缩洗涤液，使用时要按要求用蒸馏水稀释成工作液，用于洗板去除未结合物质。
终止液：通常为硫酸溶液，加至反应孔中可终止酶促反应。
操作步骤准备：试剂盒从冰箱取出后在室温复温 30 分钟左右，同时将浓缩洗涤液稀释成工作液。
加样：设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，标准品孔加入不同浓度的标准品 50 - 100μL；样本孔加入适量待测样本，再加样品稀释液；空白对照孔不加。
温育：将酶标板置于 37℃恒温箱或水浴锅中温育 1 - 2 小时。
洗板：弃去孔内液体并拍干，每孔加满洗涤液，静置 1 - 2 分钟后甩去，重复 3 - 5 次。
加酶标工作液：每孔加适量的酶标工作液，空白对照孔不加，再次 37℃温育 30 分钟 - 1 小时。
再次洗板：重复步骤 4 的洗板操作。
显色：每孔先加显色剂 A 液，再加显色剂 B 液，37℃避光显色 15 - 20 分钟。
终止：每孔加终止液 50μL，反应液颜色由蓝变黄。
测定与计算：在终止后的 15 分钟内，用酶标仪测 450nm 处 OD 值，依据标准品的浓度 - OD 值曲线，计算出样品中 HPF4 抗体的浓度。
性能特点精密度：批内变异系数一般 CV＜10%，批间变异系数 CV＜12%，能保证实验结果有较好的重复性。
特异性：试剂盒的抗体或抗原对牛 HPF4 抗体有较强的特异性识别能力，与牛体内其他的免疫球蛋白、细胞因子等物质无明显交叉反应。

双抗夹心法是 ELISA 中最常用的定量检测技术，核心是通过两种特异性抗体 “捕获 + 检测” 目标抗原，实现高灵敏度、高特异性的定量分析。

显色与定量：加入酶底物（如 TMB、OPD），酶（常用 HRP、AP）催化底物显色，显色强度与样本中抗原浓度正相关。加入终止液终止反应后，用酶标仪检测吸光度，通过标准曲线计算样本中抗原的具体浓度。

二、关键特点
特异性高：两种抗体均针对目标抗原，且识别不同表位，交叉反应风险低，能有效排除杂蛋白干扰。
灵敏度强：夹心结构可放大信号，酶催化反应进一步增强检测信号，能检出低至 pg/mL 或 ng/mL 级别的抗原。
适用范围广：仅适用于具有两个及以上抗原表位的大分子抗原（如蛋白质、多肽、病毒颗粒等），无法检测小分子抗原（无足够表位结合两种抗体）。
定量准确：标准曲线线性关系良好，可通过梯度浓度标准品精准推算样本中抗原浓度，重复性佳（板内 / 板间 CV 通常＜10%-15%）。

三、核心操作流程
包被：用包被缓冲液（如碳酸盐缓冲液 pH9.6）稀释捕获抗体，加入酶标板，4℃孵育 12-16 小时或 37℃孵育 2 小时，洗涤 3-5 次。

封闭：加入封闭液（如 5% 脱脂奶粉、BSA），37℃孵育 1-2 小时，封闭未结合抗体的空白位点，洗涤去除多余封闭液。

加样反应：加入梯度浓度标准品和待测样本，37℃孵育 1-2 小时，让抗原与捕获抗体充分结合，洗涤去除未结合抗原。

加检测抗体：加入酶标记的检测抗体，37℃孵育 1 小时，洗涤去除游离检测抗体。

显色：加入底物溶液，37℃避光孵育 10-30 分钟（根据试剂盒要求调整），观察显色情况。

终止与检测：加入终止液（如硫酸溶液），15 分钟内用酶标仪在对应波长（如 TMB 底物检测波长 450nm）读取吸光度。

结果计算：以标准品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，代入样本吸光度值计算抗原浓度。

四、关键注意事项
抗体选择：捕获抗体与检测抗体需配对使用，确保识别抗原的不同表位，避免交叉竞争影响结合。

洗涤步骤：每步反应后需充分洗涤（用 PBST 缓冲液），避免未结合物质残留导致背景偏高或假阳性。

反应条件控制：严格控制孵育温度、时间，底物显色需避光，终止后及时检测，避免显色过度或褪色。

试剂质量：抗体、酶标记物、底物需在有效期内储存使用，避免因试剂失效影响检测结果。

ELISA 实验数据可靠性需通过 “对照验证、重复性分析、曲线拟合质量、样本检测合理性” 四大维度综合判断，核心是满足预设质控标准。

一、对照结果是否符合标准
空白对照：吸光度（A 值）需低于试剂盒规定阈值（通常＜0.1 或 0.2A），且无明显显色，证明无试剂污染或杂光干扰。
阴性对照：A 值应接近空白对照，与阳性对照的比值需满足试剂盒要求（通常阴性 / 阳性＜0.3），无假阳性信号。
阳性对照 / 校准品：A 值需落在标准曲线线性范围内，检测浓度与已知浓度的偏差≤15%（中高浓度）、≤20%（低浓度），证明试剂活性正常。
加样回收实验：向已知浓度的样本中加入标准品，回收率需在 85%-115% 之间，说明样本无明显基质效应。

二、重复性是否达标
平行孔重复性：同一标准品或样本的 3 个以上平行孔 A 值变异系数（CV）≤10%，证明操作过程稳定，无偶然误差。
板内 / 板间重复性：板内不同孔位的标准品检测 CV≤10%，不同批次实验（同试剂盒）的标准曲线关键参数（如 EC50、斜率）偏差≤15%，确保数据可复现。
人员 / 设备重复性：不同操作人员或不同酶标仪检测同一样本，结果偏差≤10%，排除人为或设备差异导致的误差。

三、标准曲线拟合质量是否合格
相关系数（R2）：线性回归模型 R2≥0.99，四参数 logistic 回归（4-PL）R2≥0.995，证明浓度与 A 值的相关性良好。
残差分布：残差（实测值与预测值的差值）均匀分布在 0 附近，无明显趋势性偏差，避免模型拟合不当。

曲线覆盖范围：标准品低浓度点 A 值需明显高于空白对照（信噪比≥3），高浓度点无平台期过早出现，确保样本浓度在曲线有效范围内。

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