斑马鱼（Zebrafish）雌酮（Estrone）ELISA检测试剂盒

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被雌酮（Estrone）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的雌酮（Estrone）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1.  试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.  浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、100、200、400、800、1600 pg/mL

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.  样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能

1.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

2.  灵敏度： 检测浓度小于10 pg/mL。

3.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.  重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

5.  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6个月

免责声明

1.   试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

2.   严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。

标准孔溶液的浓度有什么要求？

核心结论是：标准孔溶液浓度需使吸光度处于 0.1–1.5 的线性范围，且能清晰呈现特征吸收峰，同时避免浓度过高导致的光谱偏移。

一、核心浓度要求

适配吸光度线性区间：浓度需控制在仪器线性响应范围内，吸光度优先落在 0.2–1.0 之间，既避免低浓度（＜0.1）的信号噪声干扰，也防止高浓度（＞1.5）的光饱和导致峰形扁平。

保证峰形清晰可辨：浓度需足够高，使特征吸收峰的峰值与基线差值明显（峰高≥0.3），能准确识别峰位和峰形，避免因浓度过低导致峰形模糊无法判断。

避免光谱偏移干扰：浓度不宜过高（如吸光度＞2.0），否则可能引发分子聚集或溶剂效应，导致吸收峰波长偏移，误判为滤光片问题。

二、浓度确定技巧

参考标准品吸收系数：根据朗伯 - 比尔定律（A=εbc），结合标准品的摩尔吸收系数（ε）和比色杯光程（b），反向计算目标浓度（c）。

预实验梯度验证：配制 3–5 个梯度浓度（如 0.1×、0.5×、1×、2×、5× 理论浓度），测试后选择峰形对称、吸光度在目标区间的浓度作为最终浓度。