斑马鱼（Zebrafish）促肾上皮质激素释放激素（CRH）

ELISA检测试剂盒

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被促肾上皮质激素释放激素（CRH）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的促肾上皮质激素释放激素（CRH）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5. 所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、5、10、20、40、80 pg/mL

试剂的准备

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3. 样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能

1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

2. 灵敏度： 检测浓度小于1.0 pg/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

6. 有效期：6个月

免责声明

1. 试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。

基质对照的样本基质选择对实验结果有哪些影响？

基质对照的样本基质选择直接影响实验结果的准确性、特异性和可靠性，核心影响集中在干扰消除效果和数据可比性上。

1. 非特异性干扰残留，导致结果偏高或偏低

若基质类型不匹配（如用血浆基质对照检测血清样本），基质中特有成分（如不同蛋白浓度、抗凝剂）会与抗体非特异性结合，或影响酶促显色反应。

结果可能出现假性偏高（基质成分增强显色）或偏低（基质成分抑制反应），无法真实反映样本中目标蛋白的实际浓度。

2. 基质差异导致背景校正失效

空白对照仅校正实验系统背景，而样本基质的背景信号（如自身显色、蛋白吸附）需依赖基质对照抵消。

若基质选择不当（如含目标蛋白的基质、处理流程不同的基质），无法准确扣除样本自身的背景干扰，导致检测信号失真。

3. 影响实验重复性和数据可比性

不同批次制备的基质若成分不一致（如反复冻融导致蛋白变性），或基质来源差异大（如不同物种、生理状态的血清），会导致基质对照的背景信号波动。

最终使同一样本的多次检测结果偏差大，不同样本间的数据缺乏可比性，无法得出可靠结论。

4. 特殊样本的基质干扰放大

对于溶血、脂血样本或复杂组织匀浆，若基质对照未排除这类杂质（如选择正常血清替代溶血血清基质），杂质会直接干扰抗体结合或底物反应。

可能导致检测结果完全失效，甚至出现假阳性或假阴性。