乙醇脱氢酶（ADH）活性测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝gong能是否异常。

测定原理：

ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD+没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算ADH活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器和蒸馏水。

生化试剂盒微量法的速率法的具体操作步骤是怎样的？
生化试剂盒微量法（速率法）主要用于酶活性检测，核心是通过酶标仪动力学模式连续监测吸光度变化速率来计算酶活性，具体操作步骤如下：
实验前准备
先将试剂盒中的底物工作液、酶标准品、质控品、稀释液等组分从冷藏环境取出，室温平衡 15-20 分钟，注意避免试剂反复冻融。同时制备待测样本，血清或血浆可直接使用，组织匀浆或细胞裂解液需在 4℃条件下以 8000g 离心 10 分钟取上清，若样本浓度过高，需用配套稀释液稀释并准确记录稀释倍数。随后对酶标仪进行调试，提前预热 30 分钟，设置动力学检测模式，根据检测的酶种类确定对应的检测波长，比如 CAT 选 240nm、SOD 选 560nm，同时设定读数间隔为 15-30s、循环次数 10-20 次，温育温度保持 37℃。 
96 孔板加样
实验时需设置空白孔、标准孔、质控孔和样本孔，且每个组别至少设置 2 个复孔以减少误差。加样时按顺序操作，空白孔加入 20μL 稀释液和 200μL 底物工作液；标准孔加入 20μL 梯度浓度的酶标准品和 200μL 底物工作液；质控孔加入 20μL 质控品和 200μL 底物工作液；样本孔加入 20μL 待测样本和 200μL 底物工作液。加样完成后，用移液器轻轻吹吸 3 次混匀，或启用酶标仪的振荡功能混匀 10 秒，过程中注意避免产生气泡。 

动力学检测启动
加样结束后，需在 30 秒内将反应板放入酶标仪，启动预设的动力学检测程序。仪器会按照设定的间隔自动记录各孔的吸光度值，全程保持 37℃恒温，确保酶促反应在稳定的温度条件下进行，这一步的关键是控制加样后到检测启动的时间差，保证所有孔的反应同步开始。 
数据采集与预处理
检测结束后，导出各孔在不同时间点的吸光度值。首先剔除异常数据点，然后以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制各孔的吸光度变化曲线，选取曲线中线性关系良好的区间，计算该区间内的吸光度变化速率（ΔOD/min），即单位时间内吸光度的差值。 
酶活性计算
先以酶标准品的浓度为横坐标，对应的 ΔOD/min 为纵坐标，绘制标准曲线，确保标准曲线的相关系数 R2≥0.99。然后根据样本孔的 ΔOD/min，从标准曲线上查得对应的酶浓度，若样本此前进行过稀释，需将查得的浓度乘以稀释倍数，最终得到样本的实际酶活性。 
实验后处理
实验结束后，将反应液按照实验室生物安全规范进行分类处理。未用完的试剂密封后，按说明书要求的条件冷藏保存。清洗 96 孔板和移液器吸头等实验器材，整理实验数据并做好记录，以便后续查阅和分析。