乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒说明书

                                 微量法 100T/96S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。

测定原理：

AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。

试剂四：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。

3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL上清液、160 μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化， 0s吸光值记为A1， 90s吸光值记为A2。△A测定管=A2-A1。

AchE活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 组织AchE活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（Cpr ×V样）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（W ×V样÷V样总）÷T

= 245×△A÷W

2. 细菌、细胞AchE活性

活性单位定义：每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

= 245×△A÷细胞数量

3. 血清AchE活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷V样÷T

=245×△A

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10^-4L；V样总：提取液体积，1 mL；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

1. 组织AchE活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（Cpr ×V样）÷T

= 490×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（W ×V样÷V样总）÷T

= 490×△A÷W

2. 细菌、细胞AchE活性

活性单位定义：每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

= 490×△A÷细胞数量

3. 血清AchE活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。

AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反总×10⁹)÷V样÷T

=490×△A

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10^-4L；V样总：提取液体积，1 mL；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。