β-木糖苷酶（β- xylosidase）测定试剂盒说明书

                                                    微量法100T/48S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、细菌和真菌等生物体，是催化木聚糖类半纤维素降解的关键酶，产物木糖可作为碳源应用于微生物发酵。另外，β-木糖苷酶还可以作为生物漂白剂应用于造纸工业，比传统的漂白法环保，具有广泛的应用价值。

测定原理：

β-木糖苷酶催化对硝基苯酚-β-D-木糖苷产生对硝基苯酚，对硝基苯酚在405nm处有特征吸收峰，测定405nm光吸收增加速率，可计算β-木糖苷酶活性。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体1mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心20min，取上清待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 液体：直接检测。

测定操作表：

1、 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至405nm。

2、 操作表

β-木糖苷酶活性计算公式：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y=13.226x+0.0011，R²=0.9998；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值ΔA。

1、按蛋白浓度计算

酶活定义：45℃，pH7.4时每毫克蛋白1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mg prot）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反总÷（V样×Cpr）÷T×1000

                                                       = 11.34×(ΔA -0.0011)÷ Cpr

2、按样本质量计算：

酶活定义：45℃，pH7.4时每克样品1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/g 鲜重）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反总÷（V样÷V样总×W）÷T×1000                                       = 11.34×(ΔA-0.0011)÷W

3. 按细胞数量计算：

酶活定义：45℃，pH7.4时每10⁴个细胞1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/10⁴cell）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反总÷V样×V样总÷细胞数量（万个）÷T×1000                                 =11.34×(ΔA-0.0011) ÷ 细胞数量（万个）

（4）按液体体积计算

酶活定义：45℃，pH7.4时每毫升液体1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mL）=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反总÷V样÷T×1000

                                                 =11.34×(ΔA-0.0011)

V样总：加入提取液体积，1mL； V反总：反应总体积，0.12mL；V样：反应中样品体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；1000:1μmol/L=1000nmol/L

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y=6.613x+0.0011，R²=0.9998；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值ΔA

1、按蛋白浓度计算

酶活定义：45℃，pH7.4时每毫克蛋白1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mg prot）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反总÷（V样×Cpr）÷T×1000

                                                        = 22.68×(ΔA -0.0011)÷ Cpr

2、按样本质量计算：

酶活定义：45℃，pH7.4时每克样品1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/g 鲜重）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反总÷（V样÷V样总×W）÷T×1000                                                      = 22.68×(ΔA-0.0011)÷W

3. 按细胞数量计算：

酶活定义：45℃，pH7.4时每10⁴个细胞1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/10⁴cell）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反总÷V样×V样总÷细胞数量（万个）÷T×1000=22.68×(ΔA-0.0011) ÷ 细胞数量（万个）

（4）按液体体积计算

酶活定义：45℃，pH7.4时每毫升液体1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。

β-木糖苷酶活性（nmol/min/ mL）=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反总÷V样÷T×1000

                                                =22.68×(ΔA-0.0011)

V样总：加入提取液体积，1mL； V反总：反应总体积，0.12mL；V样：反应中样品体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；1000:1μmol/mL=1000nmol/mL

ΔA控制在0.01-1范围内，若ΔA大于1，可适当减小样本量。

标准曲线线性范围为：0.01μmol/mL-0.5μmol/mL。