酸性木聚糖酶（Acidic Xylanase，ACX）测定试剂盒说明书

微量法100T/48S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定原理：

ACX在酸性环境下能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，进一步在沸水浴条件下与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540nm处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540nm吸光值增加速率，可计算ACX活力。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、恒温水浴锅，可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制：

缓冲液：液体90mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。（若出现白色絮状或颗粒状沉淀，可60℃加热溶解后使用）。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

粗酶提取：

1. 发酵液：发酵液于8000g，4℃，离心15min，取上清，作为待测样品。

2. 酶干粉：称约0.1mg，加1mL缓冲液溶解待测。

3. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL缓冲液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清待测。

测定操作表：

1、 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至540nm。

2、操作表

ACX计算公式：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 2.5554x - 0.002 ，R² = 0.9983

1. 按液体体积活力计算：

酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×10⁶

= 435× (ΔA+0.002)

2. 按蛋白浓度计算：

酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×10⁶÷Cpr

= 435×(ΔA +0.002 ) ÷Cpr

3. 按鲜重计算：

酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX活力（nmol/min/g鲜重）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×10⁶÷W

= 435×(ΔA +0.002 ) ÷W

150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V反总÷V样=300μL÷60μL=5；

10⁶：转化因子，即1mg/mL=10⁶ng/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 1.2777x - 0.002 ，R² = 0.9983

1. 按液体体积活力计算：

酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.002）÷1.2777÷150÷T×稀释倍数×10⁶

= 869.6× (ΔA+0.002)

2. 按蛋白浓度计算：

酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.002）÷1.2777÷150÷T×稀释倍数×10⁶÷Cpr

= 869.6×(ΔA +0.002 ) ÷Cpr

3. 按鲜重计算：

酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。

ACX活力（nmol/min/g鲜重）= （ΔA +0.002）÷1.2777÷150÷T×稀释倍数×10⁶÷W

= 869.6×(ΔA +0.002 ) ÷W

150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V反总÷V样=300μL÷60μL=5；

10⁶：转化因子，即1mg/mL=10⁶ng/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

注意事项

1. 吸光度变化应该控制在0.01～0.8之间，否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。

2. 试剂盒2-8℃保存，保质期3个月，建议尽快使用。