糖化酶(Glucoamylase)试剂盒说明书

微量法100T/48S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶，是一种外切型糖苷酶，它从淀粉的非还原性末端水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键，将淀粉完全水解为葡萄糖，因此广泛的应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。

测定原理

糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物，在540nm处有 光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比，可测定计算得糖化酶的活力。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体：直接检测。

测定操作

酶活性计算公式

标准曲线：y = 0.2164x - 0.0182，R² = 0.9992 

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按照蛋白含量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mg prot）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷（V样×Cpr）÷T

                        = 2.54×（△A+0.0182）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/g）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

= 2.54×（△A+0.0182）÷ W

3. 按照液体体积计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mL）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷V样÷T

                  = 2.54×（△A+0.0182）

4. 按照细胞数量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每10⁴个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/10⁴cell）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷（V样×细胞数量（万个）÷V样总）÷T

                      = 2.54×（△A+0.0182）÷ 细胞数量（万个）

V反总：反应总体积，0.11mL，V样：反应体系中加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，20min

b. 用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.1082x - 0.0182，R² = 0.9992 

1. 按照蛋白含量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mg prot）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反总÷（V样×Cpr）÷T

                        = 5.08×（△A+0.0182）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/g）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

 = 5.08×（△A+0.0182）÷ W

3. 按照液体体积计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mL）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反总÷V样÷T

            = 5.08×（△A+0.0182）

4. 按照细胞数量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每10⁴个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/10⁴cell）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反总÷（V样×细胞数量（万个）÷V样总）÷T

                                         = 5.08×（△A+0.0182）÷ 细胞数量（万个）

V反总：反应总体积，0.11mL，V样：反应体系中加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，20min

注意事项

1. 灭活样本的制备建议将样本放在沸水浴中煮沸10min，以将酶 灭活。

2. 测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样品用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。