丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）试剂盒

                                    分光光度法 50管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的 一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。

测定原理

PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液：60mL×1瓶，4℃保存;

试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存；；

试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存；

试剂三：液体25μL×2支，4℃保存；

生化试剂盒的通用测定步骤可分为 前期准备、试剂配制、参数设置、校准与质控、样本检测、结果计算 六大核心环节，具体细节如下：

一、前期准备

1. 试剂准备：检查试剂盒各组分（R1、R2、校准品、质控品等）是否齐全、无异常（如浑浊、沉淀、变色），按要求从储存环境取出，平衡至室温（通常 20~25℃，平衡时间 5~30 分钟，具体以试剂盒说明为准），轻轻摇匀备用。

2. 样本准备：确认待检测样本类型符合要求，已按规范完成采集与处理（如血清 / 血浆样本离心分离、组织匀浆制备、尿液离心去沉淀等）；若样本需稀释或预处理（如去除干扰物），提前完成相关操作。

3. 仪器准备：确认使用的生化分析仪 / 酶标仪等仪器符合试剂盒适用要求，提前开机预热，进行仪器清洁（避免残留污染），准备好所需耗材（如反应杯、移液枪头）。

二、试剂配制（如适用）

1. 即用型试剂：无需额外配制，平衡至室温后直接使用。

2. 需混合试剂：按试剂盒规定比例（如 R1:R2=4:1、3:1 等）准确混合试剂组分，现配现用，避免提前配制导致试剂失效。

3. 校准品配制：用指定稀释液（如试剂盒配套稀释液、生理盐水）将校准品稀释至所需浓度梯度（通常 3~5 个梯度，如 0、20、40、80、160 nmol/L），稀释后充分摇匀备用。

三、仪器参数设置

根据试剂盒要求及所用仪器型号，设置核心检测参数：

1. 基础参数：检测方法（终点法、速率法、两点法等）、孵育温度（通常 37℃）、反应时间（含孵育时间和检测时间）。

2. 波长参数：主检测波长（如 450 nm、540 nm，根据反应产物特征吸收峰确定），若存在背景干扰，需设置副波长进行校正。

3. 液量参数：明确试剂与样本的比例（如 R1 200 μL + 样本 20 μL，孵育后加 R2 50 μL），确保移液体积准确。

四、校准与质量控制（保障结果准确性）

1. 校准程序：将配制好的各浓度梯度校准品依次加入反应杯，按设置的参数进行检测，记录各校准品的吸光度值 / 吸光度变化率；以校准品浓度为横坐标（X 轴）、对应吸光度相关值为纵坐标（Y 轴），采用指定拟合方式（如线性回归、Spline 拟合）绘制标准曲线，要求相关系数 R2≥0.990（具体以试剂盒性能指标为准）。

2. 质控程序：同步测定高、中、低三个水平的质控品，检测完成后查看质控结果是否在规定靶值范围内；若超出范围，需排查试剂、仪器、操作等环节问题，解决后重新进行校准与质控。

五、样本检测

1. 按仪器参数设定的试剂 / 样本比例，依次向反应杯加入对应试剂和待检测样本，确保加样顺序正确（如先加 R1 和样本，孵育后再加 R2）。

2. 按规定的孵育温度和时间完成反应，避免反应不充分或过度反应。

3. 反应结束后，仪器自动读取各样本的吸光度值 / 吸光度变化率，记录原始数据。

六、结果计算与记录

1. 依据绘制好的标准曲线，结合样本的吸光度相关值，自动或手动计算样本中被测物的浓度 / 活性（如公式：被测物浓度 =（样本吸光度值 - 空白吸光度值）× 校准品浓度 /（校准品吸光度值 - 空白吸光度值））。

2. 记录检测结果，同时标注校准曲线相关系数、质控结果等关键信息，便于后续结果追溯与验证。

注意事项：

生化试剂盒的质量控制贯穿生产制备、储存运输、实验使用全流程，核心目标是保障试剂盒的稳定性、重复性、准确性和特异性，确保检测结果可靠。以下是分阶段的质量控制要点：
一、 生产环节的质量控制（厂家端核心质控）
这是试剂盒质量的基础，厂家需建立标准化生产流程和严格的质检标准：
原料质控
核心原料（酶、抗体、底物、标准品、缓冲液组分等）需选择高纯度、高活性的供应商，每批次原料需检测活性、纯度、稳定性、交叉反应率。例如，酶类原料需测定比活性，抗体需验证特异性，避免杂蛋白或杂质干扰后续反应。
标准品需溯源至国家或国际标准物质（如 NIST 标准品），确保浓度精准，且需检测标准品的均匀性和稳定性（如加速稳定性试验）。
配方与工艺质控
试剂配方需经过优化验证，确定各组分的 浓度比例，保证反应的灵敏度和线性范围。例如，酶促反应试剂盒需优化酶浓度、底物浓度、pH 值、离子强度，避免底物不足或酶抑制导致的反应饱和。
生产过程需遵循 GMP（良好生产规范），控制环境温度、湿度、无菌条件，避免污染；液体试剂需控制分装精度，粉剂试剂需保证称量误差在 ±1% 以内。
成品出厂质控
性能指标检测：每批次试剂盒需抽样检测关键指标，包括：
准确性：用标准品检测回收率，回收率需在 90%-110% 之间；
精密度：测定批内变异系数（CV≤10%）和批间变异系数（CV≤15%），确保同批次和不同批次试剂盒的重复性；
灵敏度：检测 检出限（LOD），需符合说明书标注值；
线性范围：用梯度浓度标准品验证，线性相关系数 R2≥0.99；
特异性：加入干扰物质（如血红蛋白、脂质、胆红素）或类似物，验证试剂盒抗干扰能力，交叉反应率需≤5%。
稳定性测试：通过实时稳定性试验（按说明书储存条件放置 6-12 个月，定期检测性能）和加速稳定性试验（37℃放置 7-14 天，模拟长期储存），确定试剂盒的有效期；冻融型试剂需检测反复冻融（3-5 次）后的活性变化。

二、 储存与运输环节的质量控制
试剂盒的活性易受温度、光照等因素影响，储存运输需严格遵循要求：
运输条件控制
根据试剂盒类型选择运输方式：需冷藏的试剂盒（2-8℃）用冰袋 + 保温箱运输，需冷冻的试剂盒（-20℃）用干冰运输，避免运输过程中温度波动（如冰袋融化导致温度升高）。
运输过程需监控温度，配备温度记录仪，确保全程温度符合要求，防止试剂失活。
储存条件控制
实验室接收试剂盒后，需立即按说明书要求储存：避光试剂需装入棕色瓶或避光袋，易氧化试剂（如底物液）需密封保存，避免接触空气；严禁将试剂盒置于高温、强光或反复冻融的环境中。
试剂盒开封后需标注开启时间，部分试剂（如酶工作液）需分装后储存，减少反复冻融次数。

三、 实验使用环节的质量控制（实验室端关键质控）
这是确保实验结果可靠的核心步骤，实验人员需严格执行以下质控措施：
实验前质控准备
试剂盒验收：新批次试剂盒使用前需进行预实验验证，用已知浓度的标准品和质控品检测，确认线性范围、回收率、重复性是否符合说明书要求，不合格批次需及时退换。
试剂平衡：将试剂盒从冷藏 / 冷冻环境取出后，需在室温下平衡 15-30 分钟，避免温度差导致反应速率异常（如低温下酶活性降低）。
仪器校准：分光光度计 / 酶标仪需定期校准（如用标准滤光片校准波长），每次实验前用空白对照液调零；移液枪需定期校准，确保加样量准确，枪头一次性使用，防止交叉污染。
样本质控：样本需按说明书要求处理（如离心去除杂质、稀释至线性范围），避免溶血、浑浊、高脂样本的干扰；设置样本复孔（2-3 个），减少加样误差。
实验过程质控
设置质控对照：每批次实验必须设置以下对照，缺一不可：
空白对照：仅加试剂和稀释液，无样本，用于扣除背景吸光度；
标准曲线：用梯度浓度标准品绘制，确保 R2≥0.99，超出线性范围的样本需稀释后重测；
质控品对照：使用试剂盒配套的低、中、高浓度质控品，检测结果需落在质控范围内，若超出范围，需排查试剂、仪器或操作问题。
严格控制反应条件：孵育温度和时间需精准把控（如水浴锅温度波动≤±0.5℃），不同孔的孵育时间差≤1 分钟；终止反应需一次性完成，避免部分孔反应过度。
实验后数据质控
数据筛选：剔除复孔中偏差过大的数据（如 CV＞10%），若多数复孔数据异常，需重新实验；
结果验证：若检测结果与预期差异较大，需排查是否存在试剂失效、样本干扰、仪器故障等问题；
记录归档：完整记录试剂盒批次号、实验条件（温度、时间、波长）、标准曲线参数、质控品结果，便于后续追溯。

四、 长期质量控制管理
建立质控档案：实验室需对每批次试剂盒的使用情况、质控结果进行记录，形成数据库，对比不同批次试剂盒的性能差异，选择稳定性好的批次。
定期能力验证：参加实验室间的能力验证试验（如临床检验中心的室间质评），通过与其他实验室的结果对比，评估试剂盒的准确性和实验室操作水平。
及时反馈与优化：若发现试剂盒质量问题（如活性下降、重复性差），需及时与厂家沟通，反馈问题并要求改进；厂家则需根据用户反馈调整生产工艺，持续优化试剂盒质量。

相关产品：