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测定意义

  辅酶 NAD(H)Ⅰ广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成 ATP 的同时，形成大量的 ROS，同时 NADH 再生为 NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒，在 570 下检测吸光值；而 NAD+可被脱氢酶还原为NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。

需自备的仪器和用品

酶标仪、台式离心机、移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，低温保存；

碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，低温保存；

试剂一：液体 10 mL×1 瓶，低温保存；

试剂二：液体 3 mL×1 瓶，低温保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂 低温保存一周；

试剂四：粉剂×1 瓶，低温保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂低温保存一周；

试剂五：液体 3.6mL×1 瓶，低温保存；

试剂六：液体 30mL×1 瓶，低温保存；

试剂七：液体 50mL×1 瓶，低温保存。

NAD+和 NADH 的提取

NAD+的提取：按照血清(浆)体积(mL)：酸性提取液体积(mL)为  1：5～10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆)，加入 1mL 酸性提取液)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)； 冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：按照血清(浆)体积(mL)：碱性提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆)，加入 1mL 碱性提取液)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)； 冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2 组织中 NAD+和 NADH 的提取

NAD+的提取：按照组织质量(g)：酸性提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议取约 0.1g 组织，加入 1mL 酸性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和， 混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：按照组织质量(g)：碱性提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议取约 0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液)，冰浴研磨，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和， 混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取

NAD+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(104 个)：酸性提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液)， 超声波破碎(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH  的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量(104 个)：碱性提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液)，超声波破碎(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次)，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

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测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570，蒸馏水调零。

2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样)：

充分混匀，静置 5min 后，20000g，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入：

混匀，取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若 NAD+测定中△A(A2-A1)≤0.0302，NADH 测定中△A(A2-A1)≤0.0222，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：(1)将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min；(2)在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个 NAD+或 NADH.

NAD+和 NADH 含量的计算

(一) NAD+含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.1475x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中 y 为△A，x 为 NAD+浓度纳摩尔/mL

1、血清(浆)中 NAD+含量计算

NAD+含量(纳摩尔/mL)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302)

2、组织、细菌或细胞中 NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD+ (纳摩尔/mg prot)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NAD+ (纳摩尔/g  鲜重)= [(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NAD+ (纳摩尔/10⁴ cell)=[(△A -0.0302)÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302)

(二)NADH 含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.1404x + 0.0222，R2 = 0.9976；其中 y 为△A，x 为 NADH 浓度 ol/mL

1、血清(浆)中 NADH 含量计算

NADH 含量(纳摩尔/mL)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222)

2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (纳摩尔/mg prot)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADH (纳摩尔/g  鲜重)=[(△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADH (纳摩尔/10⁴ cell)= [ (△A -0.0222)÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222)

V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清(浆) 体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

注意： 检测限为 0.1纳摩尔/mL 或 0.1纳摩尔/g 鲜重或 0.001纳摩尔/mg prot