NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）测试盒

一、产品描述

苹果酸脱氢酶（MDH）广泛存在于动植物、微生物和培养细胞中，能够催化苹果酸与草酰乙酸间的可逆转换，在细胞线粒体能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢等多种生理活动中扮演着重要的角色。根据不同的辅酶特异性，苹果酸脱氢酶分为NAD-依赖型和NADP-依赖型，细菌中通常只含有NAD-MDH，真核细胞中NADP-MDH多分布于细胞质和线粒体中。

NAD-苹果酸脱氢酶能够催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，NADH在340 nm处具有特征吸收峰，通过吸光值的变化即可表征NAD-苹果酸脱氢酶的活性。

二、产品内容

三、产品使用说明

测定过程中所需要的仪器和试剂：紫外分光光度计、1 mL石英比色皿（光径10 mm）、研钵/匀浆器、可调式移液器、台式离心机、恒温水浴/培养箱和蒸馏水。

1.粗酶液的制备（可根据预实验结果适当调整样品量及比例）

①组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：（5-10）的比例（建议称取0.1 g组织，加入1 mL提取液）处理样品，冰浴匀浆，4℃ 10000 g离心10 min，取上清置于冰上待测。

②细菌或细胞：离心收集细菌或细胞至离心管内，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为（500-1000）：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1 mL提取液）处理样品，冰浴超声破碎（功率20%或200 W，超声3 s，间隔10 s，重复30次）；4℃ 10000 g离心10 min，取上清置于冰上待测。

③血清（浆）、培养液等液体样品：直接检测或适当稀释后再进行检测。

NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）测试盒

2.测定步骤

①紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。

②试验前将试剂一37℃预热20 min。

③在1 mL石英比色皿中依次加入下列试剂：

吸光值测定：①充分混匀并立即开始计时，测定10 s时（总时间）340 nm处吸光值，记为A1测定和A1空白；②37℃恒温准确反应60 s，测定70 s（总时间）时340 nm处吸光值，记为A2测定和A2空白；③计算ΔA测定=A1测定-A2测定，ΔA空白=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定-ΔA空白。注：空白组只需测定1-2次。

四、注意事项

①粗酶液制备过程必须在冰上进行，保持低温环境以防止酶变性失活；

②试验过程中试剂二、试剂三和粗酶液需置于冰上放置，以防止变性和失活；

③若ΔA大于0.5，建议将粗酶液适当稀释后再进行测定，计算时相应修改；

④准确在10 s和70 s处完成吸光值测定，以确保实验结果的准确性和重复性；

⑤为保证结果准确且避免试剂损失，测定前请仔细阅读说明书（以实际收到说明书内容为准），确认试剂储存和准备是否充分，操作步骤是否清楚，且务必取2-3个预期差异较大的样本进行预测定，过程中问题请您及时与工作人员联系。