猴核因子κB (NFκB)ELISA试剂盒

一、 实验原理

是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人胰岛素受体α(INSRA)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并 洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成 终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰岛素受体α(INSRA)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

二、样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能人上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

三、本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：
① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。

四、ELISA试剂盒组成

五、注意事项

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 实验还需要酶标仪（450nm），37℃恒温箱，高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL以及蒸馏水或去离子水。

11. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

12. 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

13. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

六、操作步骤

七、实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

影响因素编辑 播报
酶联免疫(ELISA)是如今检验科常用的免疫学检测方法之一，其操作简单，无须特殊设备，使其在各级医院都有应用。但是，如果忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性，因此，了解影响实验的因素，减少差错事故的发生是极其必要的。
素质因素
实验室人员的素质主要包括五个方面：思想素质、文化素质、技术素质、心理素质、身体素质。首先应具备一个良好的思想素质，因为我们的服务对象是人，我们的道德水平直接关系到人们的健康和生命安危，如果马马虎虎。三心二意，难免会有差错事故发生，我们应该热爱专业，耐心细致。在工作中如标本混淆、张冠李戴、报告单发错等都有可能造成严重后果；其次文化素质和技术素质，我们要熟练掌握本专业的基本理论和基本技术，认真学习新理论新知识，努力提高自己的业务水平，创造一个能够胜任本职工作的技术平台。良好的心理素质就是要勇于面对工作生活中的挫折，在繁忙工作中，有条不紊，冷静沉着的处理有关事务。人员素质问题是影响检验结果的首要因素。
标本处理因素
实验室人员收到标本后应认真查对，对不符合要求的标本和申请单要拘收，合格标本要及时分离血清，避免溶血，提取血清时不应混有大量纤维蛋白或细胞成分。对不能及时检测的标本要妥善保存于4℃冰箱，做好原始记录，标本管上 标上待检者姓名、日期。从冰箱取出的标本要预温至室温，对冰冻的样品要融化好，并充分混匀再用